البكتيريا الموجودة في عينة بواسطة طريقة التصفيح بالتصفيق الزراعي أو طريقة عدد اللوحات الكلية (TPC)

مجموع عدد اللوحات (TPC):

تعداد البكتيريا الموجودة في عينة من طريقة طلاء أجار التخفيف المتسلسل أو طريقة العد الكلي للوحة (TPC).

غرض:

مدى النشاط البكتيري في عينة معينة في مجموعة محددة من الحالات يعتمد بشكل رئيسي على العدد الكلي للبكتيريا الموجودة فيها بغض النظر عن نوعها.

ولذلك ، فإنه من المطلوب في كثير من الأحيان معرفة العدد الإجمالي للبكتيريا الموجودة في عينات الطعام والماء والتربة والهواء والنسيج أثناء تحليلها الميكروبيولوجي. هذا العدد الإجمالي للبكتيريا يحتوي على كل من البكتيريا الحية والميتة. لا يمكن للبكتيريا الميتة أن تنمو وتتكاثر.

هي فقط البكتيريا الحية (البكتريا القابلة للحياة) ، والتي يمكن أن تنمو وتتكاثر مما يؤدي إلى نشاط جرثومي معين. لذلك ، غالبا ما تكون هناك حاجة لتعداد خلايا البكتيريا قابلة للحياة في عينات مختلفة. ومع ذلك ، فإن معظم طرق العد مثل العد الميكروسكوبي المباشر ، وعدد الخلايا الإلكترونية ، والطرق الكيميائية وطريقة القياس الطيفي تحسب كل من الخلايا الحية وكذلك الخلايا الميتة.

هذه الأساليب لا يمكن أن تميز بين الأحياء والخلايا الميتة. ولذلك ، فإن طريقة التصفيح المتسلسل لآغار تمييع ، الذي يعدد فقط خلايا البكتيريا الحية ، هي الطريقة المستخدمة عالميا لحساب الخلايا الحية الحية في عينات مختلفة.

المبدأ:

يتم تجانس وزن معين من العينة الصلبة بشكل معقم معقمًا في تسعة مجلدات من محلول ملحي معقم للحصول على تعليق متجانس للبكتيريا. يتم استخدام عينة السائل مباشرة كمعلق للبكتيريا متجانسة. يتم تمييع معلقات البكتيريا التي تم الحصول عليها بشكل متسلسل (10 مرات ، 100 مرة ، 1000 مرة ، وما إلى ذلك). هنا تسمى 10 -1 ، 10 -2 ، 10 -3 وما إلى ذلك التخفيفات.

وتسمى المعاملة بالمثل (10 1 ، 10 2 ، 10 3 وما إلى ذلك) بعوامل التخفيف. يتم تلقيح حجم معين من تعليق البكتيريا من كل التخفيف على لوحات أجار وينتشر بشكل صحيح ، وذلك لفضاء الخلايا البكتيرية الفردية على نطاق واسع وعزلها عن بعضها البعض.

يتم إجراء التلقيح للبكتيريا لتعدادها بتقنيتين على النحو التالي:

1. صب تقنية لوحة

2. تقنية لوحة انتشار

1. صب لوحة تقنية:

في هذه التقنية ، يتم إسقاط 1 مل من المعلق البكتيري على طبق بتري معقم ثم يتم سكب وسط آغار المغذيات المسالة فوقه. يتم تحريك طبق بتري بلطف ، وذلك للسماح لمزيج التعليق بالوسيط المتوسط. يسمح لها بالبرودة والصلابة.

2. انتشار لوحة تقنية:

في هذه التقنية يتم إسقاط 0.1 مل من تعليق البكتيريا على طبق آغار. ثم ، يتم نشر قطرة تعليق بشكل موحد على لوحة أجار عن طريق رش الزجاج المعقم.

لتقليل الخطأ ، يتم تعليق كل تعليق مخفف على ألواح مكررة من 2-5. يتم تحضين الأطباق الملقحة عند 37 درجة مئوية لمدة 24 ساعة. خلال هذه الفترة ، تنمو كل خلية بكتيرية فردية معزولة على صفيحة أجار وتتكاثر بسرعة لإنتاج كتلة مرئية مرئية من خلايا بكتيرية تسمى "مستعمرة". وهكذا ، فإن عدد المستعمرات على الصفيحة يمثل عدد البكتيريا في العينة.

ومع ذلك ، في كثير من الأحيان ، أثناء الانتشار ، قد لا يتم فصل بعض الخلايا بشكل صحيح وبعض الخلايا غير المفصولة قد تؤدي إلى مستعمرة واحدة. علاوة على ذلك ، هناك عدد قليل من الخلايا يميل إلى البقاء في أزواج أو سلاسل أو مجموعات.

هنا ، كل زوج ، سلسلة أو كتلة تنتج مستعمرة. وهكذا ، فإن كل مستعمرة ، بالمعنى الدقيق للكلمة ، لا تمثل بكتيريا واحدة. هذا هو السبب ، بدلا من التعبير عن تهم البكتيريا بأنها "لا. من البكتيريا / جم أو مل من العينة ، غالبا ما يتم التعبير عنها على أنها عدد وحدات تشكيل المستعمرة لكل جرام أو مل (CFU / gm أو ml).

يتم حساب إجمالي عدد اللوحات (TPC) في العينة الأصلية بضرب عدد وحدات المعالجة المركزية (CPU) مع عوامل التخفيف ذات الصلة. يتم اتباع "قواعد التعداد" ، مع حساب عدد البكتيريا في العينة الأصلية.

المواد المطلوبة:

أطباق بتري (15 عددًا) ، ماصات 2 ميليلتر (10 أرقام) ، ماصة 10 مل (1 رقم) ، أنابيب اختبار (10 عدد.) ، قوارير مخروطية (500 مل و 1 لتر - 1 لكل منها) ، كوب سعة 500 مل (2 رقم) ، كاسحة زجاجية ، حالة ماصة من الصلب غير القابل للصدأ ، ورق حرفة ، خيط (أو شريط مطاطي) ، قطن غير ماصة ، كحول إيثيل ، كلوريد صوديوم (NaCl) ، حمض الهيدروكلوريك 0.1N (HCI) ، 0،1 هيدروكسيد الصوديوم (NaOH) ، ماء مقطر ، أجار مغذي ، عينة سائلة (مثل ماء البركة / مياه الصرف الصحي) ، عينة صلبة (مثل لحم / لحم سمكة / لحم محار / غذاء معالج) ، ورق أس هيدروجيني (pH) ، مدقة وملاط (أو homogeniser) ، الموقد bunsen ، فرن الهواء الساخن ، الأوتوكلاف ، حاضنة ، غرفة تدفق الصفحي ، مواجهة مستعمرة كيبيك.

إجراء:

1. 10 ماصات (في حالة ماصة الفولاذ المقاوم للصدأ) ، يتم تعقيم 15 أطباق بتري وزوج من مدقة ومدافع الهاون (أو كوب واحد homogeniser) في فرن الهواء الساخن عند 180 درجة مئوية لمدة 3 ساعات. بدلا من ذلك ، يمكن تغطيتها بورق حبيبي ، مرتبطة مع الخيط أو الشريط المطاطي وتعقيمها في الأوتوكلاف جنبا إلى جنب مع المتوسط ​​(الشكل 6.6).

يتم حساب عدد أطباق بتري ، وبالتالي يتم حساب كمية الوسيطة المستخدمة وفقًا لعدد النسخ والتخفيف المطلوب. هنا ، تم أخذ الأواني الزجاجية والوسيط لتكرار واحد وتخفيف حتى 10 -6 . عدد الأواني الزجاجية وكمية الوسيط المستخدمة للتعقيم هو أكثر قليلاً لتجنب أي خطأ عرضي ، لأن التعقيم عملية طويلة.

2. تذاب 4.25 غرام من NaCl في 500 مل من الماء المقطر للحصول على محلول ملحي فسيولوجي (0.85 ٪). يسكب 225 مل من هذا المحلول الملحي في دورق مخروطي سعة 500 مل. فمه متصل بالقطن ومغطى بورق حرفي ومربوط بخيوط أو شريط مطاطي. يتم استخدامه كمواد مخففة أولى لتخفيف العينة الصلبة.

3. يتم أيضا pipetted 9.0 مل من اليسار أكثر من المياه المالحة في كل من أنابيب اختبار 10. أفواههم موصولة بالقطن ومغطاة بورق حرفي ومربوطة بخيط أو شريط مطاطي. وتستخدم هذه المواد المخففة للتخفيف المسلسل.

4. يتم وزن مكونات محلول آجار المغذيات أو مسحوقها الجاهز المطلوب لـ 500 مل من الوسط في 500 مل من الماء المقطر في دورق مخروطي بسعة 1 لتر من خلال الاهتزاز والدوران.

يتم تحديد درجة الحموضة باستخدام ورقة pH أو متر الرقم الهيدروجيني وتعديلها إلى 7.0 باستخدام 0.1N HC1 إذا كانت أكثر أو باستخدام Na 0H إذا كان أقل. يتم تسخين القارورة لإذابة الأجار في الوسط بشكل كامل. ثم ، يتم توصيله بالقطن ومغطى بورق حرفي ومربوط بخيوط أو شريط مطاطي.

5. القارورة المخروطية سعة 500 مل تحتوي على 225 مل من المحلول الملحي ، أنابيب اختبار 10 تحتوي على 9 مل من المياه المالحة ، والقارورة المخروطية سعة 1 لتر تحتوي على 500 مل من وسط أجار المغذيات يتم تعقيمها عند 121 درجة مئوية (ضغط 15 رطل / بوصة مربعة) لمدة 15 دقيقة في الأوتوكلاف.

6. بعد التعقيم ، تتم إزالة المواد المعقمة من الأوتوكلاف ويسمح لها بالتبريد لبعض الوقت ، دون السماح للوسط بالتصلب. التبريد للوسط يمنع التكثيف وتراكم قطرات الماء داخل الصفائح. إذا كان الوسيط قد تم تحضيره وتوطيده بالفعل أثناء التخزين ، فيجب تسليته عن طريق التسخين بعناية حتى يذوب تماما.

7. لتحضير أطباق أجار ، قبل أن يبرد وسط أغار المغذيات المعقمة ويصلب ، في حالة منصهرة دافئة ، يتم سكبها بشكل معقم في 6 أطباق بتري المعقم (حوالي 20 مل لكل منها) ، بحيث يغطي الوسط المنصهر الجزء السفلي من البتري أطباق تماما.

ثم تغطى الألواح بأغطيةها ويسمح لها بالبرودة ، حتى تصلب الوسط فيها. يتم تبخر بخار الماء الذي قد يتكثف على السطح الداخلي للأطباق والأغطية عن طريق الحفاظ على الصفائح والأغطية في وضع مقلوب في الحاضنة عند 37 درجة مئوية لمدة ساعة تقريبًا.

8. 25 جم من العينة الصلبة (مثل لحم السمك / لحم المحار / الأغذية المجهزة) هو وزن ومتجانسة في 225 مل من محلول ملحي (مخفف) مطهر (الشكل 6.7). هذا يعطي تخفيف 10 مرات (تخفيف = 10 -1 ). لعينة السائل ، يتم pipetted 1ml عينة من العينة بشكل معقم في أنبوب ملحي معقم 9 مل. هذا يعطي أيضا تخفيف 10 مرات (تخفيف = 10 -1 ).

9. يتم نقل 1 مل من التخفيف 10-1 إلى 9 مل من محلول ملحي معقم في أنبوب اختبار آخر. هذا يعطي تخفيف 100 مرة (تخفيف = 10 -2 ). من التخفيف 10 -2 ، يتم إسقاط 1 مل في طبق بتري معقمة و 0.1 مل على طبق أجار ، من نفس ماصة. لكل تمييع يتم استخدام ماصة معقم منفصلة. بعد الاستخدام يتم غمسها في جرة التخلص.

10. يتم نقل 1 مل من التخفيف 10 -2 إلى 9 مل من محلول ملحي معقم في أنبوب اختبار آخر. هذا يعطي تخفيف 1000 مرة (تخفيف = 10 -3 ). من التخفيف 10-3 ، يتم إسقاط 1 مل في طبق بتري معقمة و 0.1 مل على طبق آغار ، من نفس ماصة. بطريقة مماثلة ، يستمر التخفيف حتى 10 -6 بشكل تسلسلي ، في كل مرة ينقل 1 مل إلى طبق بتري معقم و 0.1 مل إلى طبق آغار من نفس الماصة.

11. ثم ، يتم نشر قطرات من تعليق على لوحات أجار مطهر من قبل رش زارع معقم. بعد الإنتشار في كل صفيحة ، يتم تعقيم اللهب بالغطس في الكحول وإظهار اللهب. هذا هو "تقنية لوحة انتشار".

12. تؤخذ أطباق بتري تحتوي على 1 مل من تعليق البكتيريا ويتم سكب أجار المغذيات المسالة المعقمة فيها. يتم تحريكها بلطف ، وذلك للسماح لمزيج التعليق بالوسيط المتوسط. يسمح للوحات بالتبريد حتى تصلب الوسط. هذا هو "تقنية لوحة صب".

13. ثم ، يتم تحضين لوحات في موقف مقلوب ، من أعلى إلى أسفل ، عند 37 درجة مئوية لمدة 24 ساعة في حاضنة (الشكل 6.7).

14. يتم تحضين لوحة أجار غير تلقيح كمراقبة لضمان التعقيم السليم كما هو مبين من قبل أي نمو على ذلك.

الملاحظات:

يتم حساب عدد مستعمرات البكتيريا على الصفائح مباشرة أو بمساعدة من مستعمرة كيبيك. من هذا ، يتم حساب عدد البكتيريا الموجودة في كل غرام أو مل من العينة الأصلية. وهذا ما يسمى التعداد.

قواعد التعداد:

1. ينبغي النظر في أطباق بتري مع 30 إلى 300 مستعمرة.

2. يعتبر متوسط ​​عدد التكرارات والترايبات (R 1 ، R 2 R 3 ...) فقط إذا كان العدد لا يزيد عن ضعف الآخر. إذا كان واحد هو أكثر من ضعف من يتم أخذ أقل قيمة أخرى.

3. لتقنية لوح الصب ، العد البكتيري هو رقم X 10 c / gm ، حيث c = عامل التخفيف. بالنسبة لتقنية لوحة الانتشار ، العد البكتيري هو رقم X10 c + 1 / gm ، حيث c = عامل التخفيف. يتم تحويل الرقم إلى منزلتين عشريتين في شكل (x.yz X 10 m ). على سبيل المثال ، يتم التعبير عن 288 X 10 4 باسم 2.88 X 10 6 .

4. إذا كان رقم المستعمرة أكثر من 300 ، في جميع التخفيفات ، عد لأعلى تخفيف وإذا كان في جميع التخفيفات ، فإنه أقل من 30 ، ويعتبر العد لأقل التخفيف. في كلتا الحالتين يتم تمثيل العد على النحو التالي: المقدرة رقم X 10 c / gm أو ml لتقنية صفيحة الرمل وتقدير X 10 c + 1 / gm أو ml لتقنية لوحة الانتشار.

.5 إذا ﻟﻢ ﻳﺘﻢ ﻣﻼﺣﻈﺔ أي ﻣﺴﺘﻌﻤﺮة ﻓﻲ أي ﺗﺨﻔﻴﻒ ﺗﻢ أﺧﺬهﺎ ، ﻳﺘﻢ ﺗﻤﺜﻴﻠﻬﺎ ﻋﻠﻰ اﻟﻨﺤﻮ اﻟﺘﺎﻟﻲ: ﺗﻘﺪﻳﺮ أﻗﻞ ﻣﻦ 1 × أﻗﻞ.

6. بما أن التخفيف المتسلسل يحدث من 10 مرات ، من الواضح رياضياً أنه لا يمكن أن يكون هناك تخفيفان في المستعمرات ما بين 30 و 300. على سبيل المثال ، إذا كان 10 -3 يحتوي على 50 مستعمرة ، فيجب أن يكون لدى 10-2 500 (أي 300) و10-4 يجب أن يكون 5 (أي <30) المستعمرات.

ومع ذلك ، هذا لا يحدث في الواقع ، كما لا تحدث البكتيريا كمحلول متجانس. بدلا تحدث كتعليق في المواد المخففة. إذا كان هناك نوعان من التخفيفات التي تحتوي على مستعمرات محسوبة (بين 30 و 300) قم أولاً بحساب عدد وحدات تشكيل المستعمرات / gm أو ml باستخدام كل تخفيف.

إذا كانت إحدى القيم أكثر من ضعف الأخرى ، فأبلغ عن القيمة الأقل. إذا لم يكن الأمر كذلك ، فخذ متوسط ​​القيمتين وقم بالإبلاغ عن تلك القيمة.