زراعة البكتيريا من العينات الصلبة والسائلة والمسبحة (مع الشكل)

غرض:

الأغراض الرئيسية لزراعة البكتيريا هي كما يلي:

1. زيادة عدد البكتيريا ، وذلك للحصول عليها في أشكال مرئية ، كمستعمرات أو تعليق.

2. عزل البكتيريا.

3. الحفاظ على ثقافة المخزون النقي والثقافات القياسية.

4. عد البكتيريا في العينات.

5. الكشف عن البكتيريا ذات الأهمية في العينة وتعدادها.

6. تحديد البكتيريا من خصائص مستعمرة ، وخصائص النمو على الميل وأنشطة البيوكيميائية في وسائل الإعلام المختلفة.

ومع ذلك ، فإن الغرض من هذه التجربة هو فقط زراعة البكتيريا من العينات السائلة والصلبة والسطحية في الوسائط الصلبة والسائلة ، وذلك للحصول عليها في أشكال مرئية كمستعمرات أو تعليق على التوالي.

المبدأ:

تستزرع البكتيريا بوسائط سائلة أو صلبة معقمة وغنية بالتغذية. يتم احتواء الوسائط السائلة ، المسماة مرق ، في أنابيب اختبار لتشكيل "أنابيب مرق" ، في حين أن الوسائط الصلبة ، تسمى وسائط الأجار ، موجودة في أطباق بتري لتشكيل "صفائح أجار" أو "أطباق" ببساطة. تحتاج زراعة البكتيريا إلى بعض المواد ، التي يشتبه في احتوائها على البكتيريا.

معظم الأشياء التي نراها تحتوي على البكتيريا. وهي موجودة في كشط الأسنان والغذاء والتربة والماء والبرازي وحتى في وسائل الإعلام الميكروبيولوجية غير المعقمة نفسها. يتم تلقيح كمية محددة من التعليق المتجانس لأي من المواد المحتوية على البكتيريا في الوسائط المعقمة معقم معقم و مطور في حاضنة عند 37 درجة مئوية لمدة 24 ساعة.

في المرق السائل ، تنمو البكتيريا كمعلق وتجعله عكرًا. على لوحات أجار صلبة ، فإنها تنمو مستعمرات. كل مستعمرة تنمو من بكتيريا واحدة. تتم زراعة البكتيريا في الخطوات الخمس التالية.

1. إعداد وسائل الإعلام

2. تعقيم وسائل الإعلام والأدوات الزجاجية

3. التلقيح

4. الحضانة

5. الملاحظة

1. إعداد وسائل الإعلام:

عادة ، في إعداد مرق السائل ووسائل الإعلام شبه الصلبة ، يتم وزن المكونات في النسب المحددة وتذوب في الكمية المطلوبة من الماء. في الوقت الحاضر ، تتوفر مساحيق وسائل الإعلام الجاهزة التي تحتوي على المكونات في النسب المطلوبة.

في إعداد وسائل مرق السائل ، يتم وزن الكمية الموصوفة من المسحوق (كما هو مذكور على ملصق العلبة) وتذوب في الكمية المطلوبة من الماء في دورق مخروطي. يتم إذابة المكونات عن طريق التسخين ، وتصب في أنابيب الاختبار وتعقيمها في الأوتوكلاف.

ولكن عند تحضير الصفائح الصلبة والميلان والأنابيب العميقة ، يتم وزن الكمية المحددة من المسحوق (كما هو مذكور على ملصق العلبة) وتذوب في الكمية المطلوبة من الماء في دورق مخروطي. يتم تعقيم هذه الوسيطة المعدة أولاً في الأوتوكلاف ومن ثم يتم تبريدها لبعض الوقت.

في حين لا يزال دافئًا ، قبل أن يتجمد ، يتم صبه في أطباق بتري المعقمة أو أنابيب اختبار ويسمح بالتصلب عند التبريد إلى درجة حرارة الغرفة. وسائل الإعلام ، في حالة حارة جدا لا ينبغي أبدا أن تصب في حاويات ، لأنه يؤدي إلى تكثيف المياه على جدار الحاويات ، والتي تسقط على سطح وسائل الإعلام ، وربما يؤدي إلى تلوثها.

2. التعقيم:

يتم تعقيم Glasswares في فرن الهواء الساخن عند 180 درجة مئوية لمدة 3 ساعات والوسائط في الأوتوكلاف عند 121 درجة مئوية (ضغط 15 رطل / بوصة مربعة) لمدة 15 دقيقة. يمكن أيضا تعقيم الزجاجيات في الأوتوكلاف ، ولكن لا يجب تعقيم وسائل الإعلام في الفرن ، حيث يهرب الماء من وسائل الإعلام ويذبل.

3. التلقيح:

يفترض أن العينات السائلة تكون معلقات متجانسة للبكتيريا. لذلك ، لزراعة في مرق ، يتم pipetted حجم معين من العينة في مرق مطهر. للزراعة على لوحات أجار ، يتم pipetted حجم واضح من العينة على لوحة أجار صلبة وانتشرت على سطح المتوسط معقم.

بالنسبة لعينات صلبة ، يتم تجانس عينة من الوزن المحدد معقمًا بشكل معقم في حجم معين من الملح الطبيعي الفسيولوجي (0.85٪ كلوريد الصوديوم) باستخدام مدقة معقمة وقذائف هاون أو خلاط. معظم مسببات الأمراض البشرية هي متساوية لجسم الإنسان (0.85 ٪ كلوريد الصوديوم).

عادة تكون نسبة العينة إلى المحلول الملحي 1: 9 (1 جم + 9 مل ؛ 10 جم + 90 مل ؛ 25 جم + 225 مل أو 50 جم + 450 مل). يتم حقن كمية محددة من هذا السائل المتجانس ، الذي يفترض أنه معلق للبكتيريا متجانسة ، بشكل معقم بشكل معقم إلى مرق معقمة في أنابيب الاختبار لثقافة المرق. للثقافة على لوحات أجار ، يتم pipatted تعليق السائل على سطح لوحات ونشرها بشكل مطهر.

بالنسبة للعينات السطحية التي يتم أخذها لدراسة علم الأحياء المجهرية للأسطح الصلبة (أسطح الطاولات ، أسطح الجسم أو الجروح) ، يفرك السطح بمسحة معقمة. تم لمس المسحة على سطح لوحة أجار معقمة. من نقطة اللمس ، يتم إنشاء خطوط بواسطة حلقة معقمة معقمًا ، وذلك لعزل البكتيريا.

4. الحضانة:

يتم تحضين أنابيب وشرائح المرق المحضرة عند 37 درجة مئوية لمدة 24 ساعة في الحاضنة.

5. الملاحظة:

يشير التعكر في المرق والمستعمرات السائلة على لوحات أجار إلى نمو البكتيريا.

المواد المطلوبة:

أطباق بتري (6 عدد.) ، ماصات 2 مل (5 عدد.) ، أنابيب اختبار (5 عدد.) ، قوارير مخروطية (100 مل ، 250 مل و 500 مل لكل لتر) ، كوب سعة 250 مل (2 رقم) ، زجاج مفرشة ، غير القابل للصدأ حالة ماصة الصلب ، ورقة الحرفية ، موضوع (أو الشريط المطاطي) ، والقطن غير ماصة ، والعصي الصغيرة ، حلقة ، الكحول الإيثيلي ، كلوريد الصوديوم (كلوريد الصوديوم) ، حمض الهيدروكلوريك 0.1N (HCI) ، هيدروكسيد الصوديوم 0.1N (هيدروكسيد الصوديوم ) ، الماء المقطر ، مرق المغذيات ، أجار المغذيات ، عينة سائلة (مثل ماء البركة) ، عينة صلبة (مثل التربة) ، عينة سطحية (مثل سطح الطاولة ، سطح الجسم ، الجرح) ، ورق أس هيدروجيني (pH) ، مدقة ومونة (أو homogeniser) ، الموقد bunsen ، فرن الهواء الساخن ، الأوتوكلاف ، حاضنة ، غرفة تدفق الصفحي.

إجراء:

1. يتم تعقيم خمسة ماصات (في علبة ماصة من الصلب غير القابل للصدأ) ، وستة أطباق بتري وزوج من المدقة والملاط (أو كوب واحد مجانسة) عند 180 درجة مئوية لمدة 3 ساعات في فرن الهواء الساخن. بدلا من ذلك ، يمكن تغطيتها بورق حبيبي ، مرتبطة مع الخيط أو الشريط المطاطي وتعقيمها في الأوتوكلاف جنبا إلى جنب مع وسائل الإعلام (الشكل 6.1).

2. تمت إذابة 0.85 جم من NaCl في 100 مل من الماء المقطر في كوب سعة 250 مل وتسكب 90 مل من هذا المحلول الملحي في دورق مخروطي سعة 100 مل. الفم موصّل بالقطن ومغطى بورق حرفي ومربوط بخيوط أو شريط مطاطي.

3. يتم وزن المكونات من مرق المغذيات المتوسطة اللازمة ل 100 مل من مرق. وكبديل لذلك ، يتم وزن الكمية الموصوفة من مسحوق مرق المغذيات الجاهزة (خليط المكونات).

4. يتم إذابة المكونات (أو المسحوق الجاهز) في 100 مل من الماء المقطر في دورق مخروطي سعة 250 مل عن طريق الاهتزاز والدوران. يتم تحديد درجة الحموضة باستخدام ورقة حمضية أو مقياس درجة الحموضة. يتم ضبط الرقم الهيدروجيني إلى 7.0 باستخدام 0.1N HCI إذا كان أكثر أو استخدام 0.1N هيدروكسيد الصوديوم إذا كان أقل. يتم تسخين القارورة ، إذا لزم الأمر ، لإذابة المكونات تمامًا.

5. يتم توزيع المرق في 5 أنابيب اختبار (حوالي 10 مل لكل منهما) ، وأغطية أفواههم مغطاة بالقطن ، ومغطاة بورق حرفي ، ومربوطة بخيط أو شريط مطاطي.

6. يتم وزن مكونات محلول أجار المغذيات أو مسحوقها الجاهز المطلوب لـ 200 مل من الوسط ويذاب في 200 مل من الماء المقطر في دورق مخروطي سعة 500 مل بالاهتزاز والدوران.

يتم تحديد درجة الحموضة باستخدام ورقة pH أو متر الرقم الهيدروجيني وتعديلها إلى 7.0 باستخدام 0.1N HC1 إذا كانت أكثر أو باستخدام Na 0H إذا كان أقل. يتم تسخين القارورة لإذابة الأجار في الوسط بشكل كامل. ثم ، يتم توصيله بالقطن ومغطى بورق حرفي ومربوط بخيوط أو شريط مطاطي.

7. يتم إجراء مسحات عن طريق لف القطن حول أطراف العصي الصغيرة. يتم الاحتفاظ القليل من هذه المسحات في أنبوب اختبار مع نصائح القطن إلى أسفل. أنبوب الاختبار موصّل بالقطن ومغطى بورق حرفي ومربوط بخيوط أو شريط مطاطي.

8. قارورة مخروطية سعة 100 مل مع ملوحة 90 مل ، أنابيب اختبار 5 مع حساء مغذ ، قارورة مخروطية سعة 500 مل تحتوي على 200 مل من أجار المغذيات المتوسطة وأنبوب اختبار يحتوي على المسحات يتم تعقيمها عند 121 درجة مئوية (ضغط 15 رطل / بوصة مربعة) 15 دقيقة في الأوتوكلاف.

9. بعد التعقيم ، تتم إزالة المواد المعقمة من الأوتوكلاف ويسمح لها بالتبريد لبعض الوقت ، دون السماح للوسط بالتصلب. التبريد للوسط يمنع التكثيف وتراكم قطرات الماء داخل الصفائح. إذا كان الوسيط قد تم تحضيره وتوطيده بالفعل أثناء التخزين ، فيجب تسليته عن طريق التسخين بعناية حتى يذوب تماما.

10. لتحضير أطباق أجار المغذيات ، قبل أن يبرد وسط أغار المغذيات المعقمة ويصلب ، في حالة منصهرة دافئة ، يتم سكبها بشكل مطهر ، إلى 6 أطباق بتري معقم (حوالي 20 مل لكل منها) ، بحيث يغطي الوسط المنصهر قاع أطباق بتري تماما.

ثم تغطى الألواح بأغطيةها ويسمح لها بالبرودة ، حتى تصلب الوسط فيها. يتم تبخر بخار الماء الذي قد يتكثف على السطح الداخلي للأطباق والأغطية عن طريق الحفاظ على الصفائح والأغطية في وضع مقلوب في الحاضنة عند 37 درجة مئوية لمدة ساعة تقريبًا.

11. يتم أخذ عينة السائل (المشتبه في احتوائها على البكتيريا ، مثل ماء البركة). يتم pipetted واحد مل كل واحد من العينات pipiped في أنابيب مرق 2 (الشكل 6.2). يتم تقليب الأنابيب. يتم أيضا pipetted العينة السائلة مطهر على لوحات 2 أجار ، كل 0.1 مل ، وانتشر على سطح وسط أجار باستخدام رش الزجاج تعقيم اللهب.

قبل كل انتشار من قبل رش الزجاج ، يتم غمره في الكحول ويلقى باللوم على موقد بنسن. يتم تحضين أنابيب وشرائح المرق المحضرة عند 37 درجة مئوية لمدة 24 ساعة في الحاضنة. وتحضن اللوحات في وضع مقلوب ، من أعلى إلى أسفل.

12. بالنسبة للعينة الصلبة (على سبيل المثال التربة) ، يتم وزن 10 جرام من العينة بشكل معقم بشكل مطهر ومتماثلة في الكأس المعقم والملاط أو المجانسة بعد إضافة 90 مل من محلول ملحي معقم من القارورة المخروطية سعة 100 مل.

هذا المعلق البكتيري المتجانس هو pipetted بشكل معقم بشكل قسري في أنابيب 2 مرق و 2 لوحات أجار كما هو الحال في الخطوة 11 وحضنت عند 37 درجة مئوية لمدة 24 ساعة في الحاضنة (الشكل 6.2). وتحضن اللوحات في وضع مقلوب ، من أعلى إلى أسفل.

.13 ﺑﺎﻟﻨﺴﺒﺔ ﻷﺧﺬ اﻟﻌﻴﻨﺎت اﻟﺴﻄﺤﻴﺔ ، ﻳﺘﻢ وﺿﻊ ﻋﻼﻣﺔ ﻋﻠﻰ اﻟﺴﻄﺢ اﻟﻤﺸﺘﺒﻪ ﻓﻲ أﻧﻪ ﻳﺤﺘﻮي ﻋﻠﻰ اﻟﺒﻜﺘﻴﺮﻳﺎ (ﺳﻄﺢ اﻟﺠﺪول ، ﺳﻄﺢ اﻟﺠﺴﻢ ، اﻟﺠﺮح) ﻟﻤﺴﺎﺣﺔ اﻟﻮﺣﺪة (ﻋﻠﻰ ﺳﺒﻴﻞ اﻟﻤﺜﺎل 1 ﺳﻢ ² ) ، واﻟﺘﻲ ﻳﺘﻢ ﻓﻜﻬﺎ ﺑﻤﺴﺤﺔ ﻣﻌﻘﻤﺔ. تمسح المسحة على سطح لوحات أجار اثنين من اليسار.

يتم التشقق بشكل معقم من خلال حلقة معقمة باللهب. بالنسبة إلى الخطوط ، يتم رسم الخطوط المتوازية تقريبًا بواسطة الحلقة من نقطة اللمس. هذه تشكل الخطوط الأولية. بعد تعقيم اللهب ، يتم رسم الخطوط الثانوية تقريبًا بشكل مائل إلى الخطوط الأولية. وبطريقة مماثلة ، يتم وضع الخطوط الثلاثية والراباعية بطريقة معقمة.

14. ثم ، وحضنت لوحات في موقف مقلوب ، من أعلى إلى أسفل ، عند 37 درجة مئوية لمدة 24 ساعة في الحاضنة (الشكل 6.2).

15- تحضن صفيحة أجار واحدة غير مصنفة وأنبوب مرق غير مرخص كوسيلة رقابة لضمان التعقيم السليم كما هو مشار إليه في عدم وجود نمو فيها. هذه الخطوة اختيارية.