اختبار Ortho-Nitrophenyl Galactoside على البكتريا لإيجاد قدراتهم على تحلل Hydrolyse Ortho-Nitrophenyl-PD-Galactoside

قراءة هذه المادة لمعرفة المزيد عن أداء اختبار Ortho-Nitrophenyl Galactoside على البكتريا لإيجاد قدراتهم على التحلل المائي Ortho-Nitrophenyl-PD-Galactoside!

المبدأ:

بعض البكتيريا لديها القدرة على تخمر اللاكتوز. وتسمى هذه البكتيريا "بكتيريا خميرة اللاكتوز" أو "اللاكتوز".

وتسمى الأخرى ، التي لا تستطيع تخمير اللاكتوز ، بكتريا اللاكتوز غير المتحملة أو "اللاكتوز - اللا فاقم".

يمكن للبكتريا التي تخمر اللاكتوز إنتاج نوعين من الإنزيمات ، هما "permease" و "gal-galactosidase" ، التي تشارك في تخمر اللاكتوز. يساعد الإلتهاب في دخول اللاكتوز إلى خلايا البكتيريا ، في حين أن β-galactosidase hydrolyses lactose to glucose and galactose ، β-galactosidase عبارة عن إنزيم محرض داخل خلوي ، ينتج إنتاجه عن وجود اللاكتوز في بيئة خلايا البكتيريا.

في حين أن البكتيريا المخمّرة لللاكتوز يمكن أن تنتج كلا من البيرميوم بالإضافة إلى gal غالاكتوزيداز ، لا تستطيع بكتيريا اللاكتوز غير المخمرة إنتاج بيرمايز ، ولكنها قد تنتج أو لا تنتج β-galactosidase. يتم إجراء اختبار ONPG لمعرفة قدرة البكتيريا اللاكتوزية غير المخمرة لإنتاج β-galactosidase.

لهذا ، يتم إذابة غشاء الخلية لخلايا البكتيريا اللاكتوزية غير المخمرة بإضافة التولوين ، وذلك لتحرير جميع الإنزيمات داخل الخلايا بما في ذلك P-galactosidase ، إن وجدت. الإنزيم ، gal-galactosidase ، يتحلل من المادة العضوية ortho-nitrophenyl-β-D-galctoside (ONPG) إلى ortho-nitrophenol ، وهو أصفر اللون.

في اختبار ortho-nitrophenyl galactoside (اختبار ONPG) ، تزرع بكتيريا الاختبار على آجر ثلاثي أجار الحديد (TSI agar) ، التي تحتوي على اللاكتوز. إذا كانت البكتريا عبارة عن اللاكتوز غير المخمر ، كما هو مشار إليه بعقب أحمر ومائل أحمر ، فإن تعليق سميك للبكتيريا يتم في محلول ملحي ، تضاف إليه تولوين متبوعًا بحل ONPG. إذا كانت البكتيريا لديها القدرة على إنتاج الإنزيم P-galactosidase ، يتغير لون تعليق البكتيريا إلى اللون الأصفر.

المواد المطلوبة:

أنابيب الاختبار ، القارورة المخروطية ، المقابس القطنية ، حلقة التطعيم ، إبرة التلقيح ، الأوتوكلاف ، الموقد ، حجرة التدفق الصفحي ، الجرة ، الحاضنة ، أجار TSI ، التولوين ، محلول O- نيتروفينيل-D-D-galactoside (ONPG) ، المستعمرات المعزولة أو ثقافات نقية من البكتيريا.

إجراء:

1. يتم وزن مكونات محلول أجار TSI (الذي يحتوي على 3 سكريات وحديد كمكونات رئيسية) أو مسحوق جاهز مطلوب 100 مل من الوسط ويذوب في 100 مل من الماء المقطر في دورق مخروطي سعة 250 مل بواسطة يهز ويحوم (الشكل 7.16).

2. يتم تحديد درجة الحموضة باستخدام ورقة الرقم الهيدروجيني أو الرقم الهيدروجيني وتعديلها إلى 7.4 باستخدام 0.1N HCI إذا كان أكثر أو استخدام 0.1N هيدروكسيد الصوديوم إذا كان أقل.

3. يسخن القارورة لتذويب الأجار في الوسط بشكل كامل.

4. قبل أن تصلب ، يتم توزيع المتوسط في حالة منصهرة دافئة في 5 أنابيب اختبار (حوالي 20 مل لكل منهما).

5. أنابيب الاختبار موصولة بالقطن ، مغطاة بورق حرفي ومربوطة بخيط أو شريط مطاطي.

6. يتم تعقيمها عند 121 درجة مئوية (ضغط 15 رطل / بوصة مربعة) لمدة 15 دقيقة في الأوتوكلاف.

7. بعد التعقيم ، يتم إزالتها من الأوتوكلاف ويتم الاحتفاظ بها في وضع مائل لتبريد وترسيخ الوسط ، وذلك للحصول على أغوار TSI أجار.

8. يتم تحصين البكتيريا التجريبية معقمًا بشكل معقم ، ويفضل في غرفة التدفق الصفحي ، إلى الميلان عن طريق الطعن في المؤخرة والتسطير على سطح الميلان بمساعدة إبرة معقمة باللهب. يتم تعقيم الإبرة بعد كل عملية تلقيح.

9. يتم تحضين الحزونات الملقحة عند 37 درجة مئوية لمدة 24 ساعة في الحاضنة.

10. إذا كانت البكتيريا هي عبارة عن خميرة لاكتوز ، فهي غير محددة لاختبار ONPG. إذا كانت البكتريا خالية من اللاكتوز ، كما هو محدد بعقب أحمر ومائل أحمر ، يتم اختيارها لاختبار ONPG.

11. إلى أنبوب اختبار يحتوي على 0.25 مل من المياه المالحة ، يتم وضع ثقافة سميكة للبكتيريا عن طريق حلقة تعقيم اللهب ، وذلك لجعل تعليق سميك للبكتيريا.

12. يتم إضافة قطرة واحدة من التولوين ، مختلطة ومحتضنة لمدة 5 دقائق عند 37 درجة مئوية.

13. يضاف محلول النيتروفينيل جالاكتوزيد (حل ONPG) ويحضن عند 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة. ثم لوحظ تغير اللون. مرة أخرى لوحظ تغير اللون بعد 24 ساعة.