اختبار أوكسيديز على البكتيريا لمعرفة قدرتها على الأكسدة مخفضة

قراءة هذه المادة لمعرفة المزيد عن اختبار أوكسيديز على البكتيريا لمعرفة قدرتها على أكسدة انخفاض cytochrome C:

المبدأ:

بعض البكتيريا لديها القدرة على انكسيداز 'cytochrome c' الموجود في خلاياها إلى 'cytochrome C' المؤكسدة ، لأنها يمكن أن تنتج إنزيم 'cytochrome oxidase'.

وينتج السيتوكروم المؤكسد C اللون الأرجواني (الورقة الأرجواني) مع صبغة N-tetramethyl-para-phenylenediamine (أي كاشف oxidase).

في اختبار الأوكسيديز ، تغمر صفائح أجار المغذيات التي تحتوي على مستعمرات بكتيريا الاختبار بمحلول كاشف أوكسيديز. إذا كانت البكتيريا لديها القدرة على إنتاج انزيم السيتوكروم أوكسيديز ، يتغير لون المستعمرات على الصفائح إلى اللون الأرجواني. إذا لم يكن لدى البكتيريا القدرة على إنتاج أوكسيديز السيتوكروم ، تحتفظ المستعمرات باللون الوردي الأصلي لكاشف الأكسيداز.

المواد المطلوبة:

أطباق بيتري ، قارورة مخروطية ، مقابس القطن ، حلقة التلحيم من البلاتين ، الأوتوكلاف ، الموقد الأوتوماتيكي ، غرفة تدفق الصفائح ، التخلص من الجرة ، الحاضنة ، شريط ورقة الترشيح واتمان ، كاشف الأوكسيديز (N- تيتراماثيريل بارفينيلنيامين) ، مستعمرات معزولة أو ثقافات نقية من البكتيريا.

إجراء:

(أ) طريقة اللوحة:

1. يتم تنظيف اثنين من أطباق بتري ، مغطاة بورق حرفة وربطها مع الخيط أو الشريط المطاطي (الشكل 7.19). يتم حذف هذه الخطوات وكذلك تعقيم أطباق بتري في الخطوة 6 ، إذا تم استخدام أطباق بتري تعقيمها الفرن مباشرة.

2. يوزن ويذوب المكونات من وسط أجار المغذيات أو مسحوق جاهز لها المطلوبة ل 100 مل من المتوسط في 100 مل من الماء المقطر في دورق مخروطي 250 مل عن طريق الاهتزاز والدوران.

3. يتم تحديد درجة الحموضة باستخدام ورقة الرقم الهيدروجيني أو الرقم الهيدروجيني وتعديلها إلى 7.0 باستخدام 0.1N HCI إذا كان أكثر أو استخدام 0.1N هيدروكسيد الصوديوم إذا كان أقل.

4. يتم تسخين القارورة لإذابة الأجار في الوسط بشكل كامل.

5. إن القارورة موصولة بالقطن ، مغطاة بورق حرفي ومربوطة بخيط أو شريط مطاطي.

6. يتم تعقيم اثنين من أطباق بتري والقارورة المخروطية التي تحتوي على متوسط أجار المغذيات عند 121 درجة مئوية (ضغط 15 رطل / بوصة مربعة) لمدة 15 دقيقة في الأوتوكلاف.

7. بعد التعقيم ، يتم إزالتها من الأوتوكلاف ويسمح لها بالبرودة لبعض الوقت ، دون السماح للوسط بالتصلب. التبريد للوسط يمنع التكثيف وتراكم قطرات الماء داخل الصفائح. إذا كان الوسيط قد تم تحضيره وتوطيده بالفعل أثناء التخزين ، فيجب تسليته عن طريق التسخين بعناية حتى يذوب تماما.

8. لتحضير أطباق أجار المغذيات ، قبل أن يبرد وسط أغار المغذيات المعقمة ويصلب ، في حالة منصهرة دافئة ، يتم سكبها بشكل معقم ، ويفضل داخل غرفة التدفق الصفحي ، في طبقتي بتري المعقمتين (حوالي 20 مل لكل منهما) ، بحيث الوسط المنصهر يغطي الجزء السفلي من أطباق بتري تماما.

ثم تغطى الألواح بأغطيةها ويسمح لها بالبرودة ، حتى تصلب الوسط فيها. يتم تبخر بخار الماء الذي قد يتكثف على السطح الداخلي للأطباق والأغطية عن طريق الحفاظ على الصفائح والأغطية في وضع مقلوب في الحاضنة عند 37 درجة مئوية لمدة ساعة تقريبًا.

9. يتم وضع علامة على كل لوحة على الجانب السفلي في أربعة أرباع.

10. "التلقيح الفوري" لبكتريا الاختبار يتم بشكل معقم ، ويفضل في غرفة تدفق الصفحي ، في مركز كل ربع من خلال جعل بقعة (أو لطخة صغيرة) من البكتيريا مع مساعدة من حلقة تعقيم اللهب. يتم تعقيم الحلقة بعد كل عملية تلقيح.

11. يتم تحضين الأطباق الملقحة في وضع مقلوب ، من الأعلى إلى الأسفل ، عند 37 درجة مئوية لمدة 24 ساعة في الحاضنة حتى تظهر مستعمرات البكتيريا.

12. غمرت المياه مع كاشف أوكسيديز.

(ب) طريقة الورق:

1. يتم تجفيف A ورقة مرشح مرشح Whatman ، انخفض في كاشف 1 ٪ أوكسيديز واحتفظ في الظلام.

2. قبل الاستخدام ، يتم ترطيبه ويتم وضع حلقة من البكتيريا التجريبية عليه كحزمة من البوصلة بمساعدة سلك من البلاتين. Nichrome حلقة يمكن أكسدة الكاشف. لذلك ، يجب استخدام حلقة البلاتين.

3. لوحظ البقعة بعد 10 ثوان.