أسباب ومنهجيات تسلسل الجينوم
تسلسل الجينوم متطور ومعقد ويتطلب تكنولوجيا متخصصة. يمكن تسلسل شريحة من 500 إلى 800 نقطة أساس. لكن الجينوم كبير جدا على سبيل المثال E. coli مع 4.2 x 10 6 bp و 3.2 x 10 9 bp للبشر.
وبالتالي هناك حاجة لتسلسل شرائح صغيرة. يتم إنتاج هذه المقاطع عن طريق كسر الحمض النووي الجينومي إلى شظايا صغيرة بشكل عشوائي. هذه الشظايا عادة تتداخل مع أجزاء أخرى في نهاياتها. يتم استنساخ أجزاء في ناقل لتوليد مكتبة الجينوم من الكائنات الحية.
أسباب إكمال التسلسل لجينوم:
(1) يوفر معلومات عن الأساس لاكتشاف الجينات ويوفر جرد الجينات.
(2) إنه يمثل العلاقات المحتملة بين الجينات.
(3) يوفر ترتيب الجينوم مجموعة من الأدوات لمزيد من التجارب.
(4) يتم توفير المعلومات الجينية للكائن الحي من التسلسل الجيني.
(5) يوفر التسلسل الجيني الكامل للكائن جميع المعلومات الجينية اللازمة لتشكيل كائن حي.
المنهجيات المستخدمة في تسلسل الجينوم:
(1) المتسلسل المباشر لثغرات الكروموسوم الاصطناعي البكتيري (BAC):
البكتريا الكروموزومات الاصطناعية هي ببساطة بلازميدات مصممة لاستنساخ أجزاء طويلة جدا (أي 100.000 إلى 300.000 برميل) من الحمض النووي. وتستخدم هذه المتجهات في إنشاء مكتبات جينومية يبلغ حجمها 80- 100 كيلوبايت. يتم استنساخ شظايا الحمض النووي من آلاف أزواج القاعدة في متجه BAC.
يتم فحص المكتبة الجينومية عن طريق تحديد النسب المقيدة المشتركة التي تسمى contigs. يحتوي أعضاء contig على بعض المناطق المتداخلة للسماح بالتحديد الدقيق لموقعهم في التوثيق.
الهدف النهائي من طرق رسم الخرائط المادية هو الحصول على مجاملة كاملة لكل كروموسوم من الجينوم. يتم ترتيب تسلسلات المعينة من خلال كسر شظايا كبيرة من الحمض النووي إلى شرائح صغيرة. كل تسلسل من contig يتم التسلسل. يتم تحديد تسلسل النوكليوتيدات بمفرده بواسطة أساس استنساخ حتى يتم تسلسل الجينوم الكامل.
(2) نهج التسلسل العشوائي للرشاش أو النهج التصاعدي:
من الممكن استنساخ كائن حي واحد من أي جينة مرغوبة من كائن حي آخر بواسطة إطلاق النار. لهذا الجينوم بأكمله من أول كائن حي يتم هضمه مع نوكليازات نقيدة لإنتاج خليط عشوائي من الشظايا.
يتم إنشاء مكتبات عشوائية (shotgim) من الحمض النووي الجيني في صغير أي 2.0 كيلو بايت ومتوسطة أي ناقلات البلازميد إدراج 10 كيلو بايت جنبا إلى جنب مع الجينوم بندقية كبيرة إدراج مكتبة BAC (80-100 كيلو بايت). يتم إدخال شظايا في ناقلات البلازميد والبلازميدات المؤتلف تحويلها إلى الخلية المضيفة المطلوبة.
في تسلسل البندقية بالرصاص يتم تحديد التسلسلات المختارة عشوائياً حتى يتم تحليل الحيوانات المستنسخة في المكتبة الجينومية. وبعبارة أخرى يمكننا القول أنه في التسلسل العشوائي ، يتم تقسيم الكروموسومات إلى أقسام ، ثم يتم تقسيم جزء الحمض النووي الجينومي إلى ملايين الأجزاء الصغيرة ، ويتم تسلسل جميع الأجزاء بطريقة غير متحيزة.
تتم مطابقة مناطق تداخل الدنا والتي شكلت أجزاء أكبر وأكبر من الحمض النووي الجيني. يتم إجراء تسلسل الحمض النووي على طرفي إدراجات الاستنساخ المختارة عشوائياً من مكتبات البلازميد المدرجة الصغيرة والمتوسطة لتوفير تغطية الجينوم ثلاث مرات على الأقل.
يتم إدخال شظايا الدنا الصغيرة في جزيئات بلازميد مختلفة بشكل عشوائي. في حالة التداخلات المتداخلة ، تأتي جميعها من نفس الموقع الجينومي ولكن من مناطق مختلفة تحولت إما إلى اليسار أو إلى اليمين نسبة إلى بعضها البعض.
يتم محاذاة الأجزاء المتداخلة إما في coting أو في تسلسل للمنطقة المعنية (طريقة البندقية بالرصاص). تحتوي جينومات بدائيات النواة على القليل من الحمض النووي الخاص بها ، وتسلسل البندقية بالرصاص يعطي نتائج جيدة. تحمل حقيقيات النوى العديد من المتواليات المتكررة.
كل هذا يؤدي إلى الارتباك. ومع ذلك ، يتم استغلال تداخل الأجزاء في مرحلة التجميع من خلال التمرينات الحسابية. يحدد برنامج الكمبيوتر التتابعات المتداخلة وينضم إليها في امتداد مستمر واحد. تم تطبيق هذه العملية بنجاح لتسلسل جميع تسلسلات الجينوم الميكروبية التي نشرتها Celera Genomics.
