اختبار Deoxyribonuclease على البكتيريا لاكتشاف قدراتهم على تحلل الحمض النووي (مع الشكل)

اختبار Deoxyribonuclease (اختبار الدناز) على البكتيريا لاكتشاف قدراتهم على تحلل الحمض النووي (مع الشكل)!

المبدأ:

بعض البكتيريا لديها القدرة على تحلل حامض الديوكسي ريبونوكلييك (DNA) إلى قليل النوكليوتيد ، لأنها يمكن أن تنتج الإنزيم الهيدروليولي خارج الخلية "ديوكسيريبونوكلياز" (الدناز).

في حين أن الحمض النووي يحصل على تعتيم من إنتاج حمض الهيدروكلوريك ، فإن منتجاته النهائية المتحللة بالماء ، قليل النكليوتيد ، لا يتم تعجيلها بواسطة حمض الهيدروكلوريك ، والتي لا ينتج عنها مثل هذه العتامة ؛ بدلا تنتج الشفافية.

في اختبار الدناز ، تزرع بكتيريا الاختبار على لوحات أجار تحتوي على د ن أ. بعد رؤية مستعمرات البكتيريا ، تغمر الصفائح بحمض الهيدروكلوريك. إذا كانت للبكتيريا القدرة على تحلل الحمض النووي DNA ، تحلل مستعمراتها الحمض النووي في الوسط في المناطق المحيطة بها ، في حين تحتوي بقية مناطق الصفائح على الحمض النووي غير المتحلل.

ونتيجة لذلك ، عند غمرها بحمض الهيدروكلوريك ، تكون المناطق الشفافة واضحة حول المستعمرات ، حيث أن المنتجات المحلمهة ، قليلة النكليوتيد ، المتكونة حولها لا تشكل رواسب مع حمض الهيدروكلوريك.

من ناحية أخرى ، تصبح بقية مناطق الصفائح معتمة ، لأن الحمض النووي غير المتحلل في هذه المناطق يتأرجح مع حمض الهيدروكلوريك. إذا تم استخدام التولودين الأزرق بدلاً من حمض الهيدروكلوريك ، يتم إنتاج هالة وردي وردية فقط حول المستعمرات.

المواد المطلوبة:

أطباق بيتري ، قارورة مخروطية ، مقابس القطن ، حلقة التلقيح ، الأوتوكلاف ، الموقد ، حجرة التدفق الصفحي ، الجرة ، الحاضنة ، أجار الدناز ، حمض الهيدروكلوريك (أو 0.1٪ تولويدين الأزرق) ، المستعمرات المعزولة أو الثقافات الصرفة للبكتيريا.

إجراء:

1. يتم تنظيف اثنين من أطباق بتري ، مغطاة بورق حرفي وربطها مع الخيط أو الشريط المطاطي (الشكل 7.23). يتم حذف هذه الخطوة وكذلك تعقيم أطباق بتري في الخطوة 6 ، إذا تم استخدام أطباق بتري تعقيمها الفرن مباشرة.

2. يوزن ويحلل في 100 مل من الماء المقطر في قارورة مخروطية سعة 250 مل عن طريق الاهتزاز والدوران ، مكونات دناز أجار متوسطة (التي تحتوي على الحمض النووي كمكون رئيسي) أو مسحوق جاهز مطلوب 100 مل من الوسط.

3. يتم تحديد درجة الحموضة باستخدام ورقة الرقم الهيدروجيني أو الرقم الهيدروجيني وتعديلها إلى 7.2 باستخدام 0.1N HCI إذا كان أكثر أو استخدام 0.1N هيدروكسيد الصوديوم إذا كان أقل.

4. يتم تسخين القارورة لإذابة الأجار في الوسط بشكل كامل.

5. إن القارورة موصولة بالقطن ، مغطاة بورق حرفي ومربوطة بخيط أو شريط مطاطي.

6. يتم تعقيم اثنين من أطباق بتري والقارورة المخروطية التي تحتوي على وسط أجار دناز عند 121 درجة مئوية (ضغط 15 رطل / بوصة مربعة) لمدة 15 دقيقة في الأوتوكلاف.

7. بعد التعقيم ، يتم إزالتها من الأوتوكلاف ويسمح لها بالبرودة لبعض الوقت ، دون السماح للوسط بالتصلب. التبريد للوسط يمنع التكثيف وتراكم قطرات الماء داخل الصفائح. إذا كان الوسيط قد تم تحضيره وتوطيده بالفعل أثناء التخزين ، فيجب تسليته عن طريق التسخين بعناية حتى يذوب تماما.

8. لتحضير أطباق أجار الدناز ، قبل أن يبرد وسط أجار دناز المعقم ويصلب ، في حالة منصهرة دافئة ، يتم سكبها بشكل معقم ، ويفضل داخل غرفة التدفق الصفحي ، إلى طبقتي بتري معقمة (حوالي 20 مل لكل منهما) ، بحيث الوسط المنصهر يغطي الجزء السفلي من أطباق بتري تماما.

ثم تغطى الألواح بأغطيةها ويسمح لها بالبرودة ، حتى تصلب الوسط فيها. يتم تبخر بخار الماء الذي قد يتكثف على السطح الداخلي للأطباق والأغطية عن طريق الحفاظ على الصفائح والأغطية في وضع مقلوب في الحاضنة عند 37 درجة مئوية لمدة ساعة تقريبًا.

9. يتم وضع علامة على كل لوحة على الجانب السفلي في أربعة أرباع.

10. "التلقيح الفوري" لبكتريا الاختبار يتم بشكل معقم ، ويفضل داخل غرفة التدفق الصفحي ، في وسط كل ربع عن طريق عمل بقعة (أو لطخة صغيرة) للبكتيريا بمساعدة حلقة معقمة على اللهب. يتم تعقيم الحلقة بعد كل عملية تلقيح.

11. يتم تحضين الألواح الملقحة في وضع مقلوب ، من الأعلى إلى الأسفل ، عند 37 درجة مئوية لمدة 24 إلى 48 ساعة في الحاضنة حتى تظهر مستعمرات البكتيريا.

12. تغمر الصفائح بمحلول حمض الهيدروكلوريك 1 ن (أو 0.1٪ بلو تولدين).