طرق فحص Immnoabsorbent المرتبط بالإنزيم (ELISA) لكشف المستضد

مقايسة Immnoabsorbent الفحص (ELISA) مرتبطة للكشف عن مستضد!

يمكن استخدام طريقة immnoabsorbent المرتبطة بالأنزيم للكشف عن المستضد أو الجسم المضاد. تتميز طريقة ELISA بالعديد من المزايا على الطرق الأخرى (الجدول 27.2).

طريقة ELISA هي 10 إلى 1000 طيات حساسة من الطرق القديمة مثل التراص و immunoelectrophoresis. تتوفر مجموعة متنوعة من تعديلات ELISA ، والتي تم وصف بعضها هنا.

الجدول 27-2: مزايا فحص المناعة الإنزيمية

1. تأثير تضخيم الإنزيمات يؤدي إلى تطوير فحوصات أكثر حساسية

2. الكواشف لها عمر تخزين طويل وهي رخيصة نسبيا

3. مجموعة متنوعة واسعة من تكوينات الفحص يمكن تطويرها

4. المعدات أقل تكلفة ومتوفرة على نطاق واسع

5. لا خطر الإشعاع

6. يمكن أن يؤديها في المختبرات الصغيرة أيضا

ELISA لفحص الأجسام المضادة:

يتم لصق مستضد معروف على الآبار لوحة ميكروليتر (صفيحة بلاستيكية صغيرة ، تعامل لزيادة الربط البروتين ؛ يحتوي على 96 بئرا مع حجم 200 ميكرولتر).

↓

يضاف مصل الاختبار البشري إلى البئر ويحضن.

أنا. إذا كان المصل يحتوي على أجسام مضادة ضد المستضد المطلي ، ترتبط الأجسام المضادة بالمستضدات.

↓

يتم غسل الآبار لإزالة مكونات المصل غير المربوطة.

↓

يتم إضافة إنزيم مترافق معانوبيلوبين مضاد للبشرية (يعرف بالترافق) إلى الآبار ويحضن.

ثانيا. يرتبط الاقتران بالأجسام المضادة المرتبطة بالمستضد في البئر.

ثالثا. إذا لم يحتوي مصل الاختبار على أجسام مضادة ضد المستضد ، يبقى المترافق في المحلول.

↓

يتم غسل الآبار لإزالة اتحاد متقارن.

↓

تضاف طبقة مناسبة إلى الآبار وتحتضن.

د. يعمل إنزيم المترافقة في الأجسام المضادة للمستضد-الأضداد المركبة على الركيزة ويقسم الركيزة لإنتاج منتج ملون. يشير تطور اللون إلى أن الجسم المضاد الخاص بالمستضد المطلي على الآبار موجود في مصل الاختبار.

v. عدم تطوير اللون يشير إلى أن مصل الاختبار لا يحتوي على أجسام مضادة ضد المستضد المغلفة على الآبار.

↓

يضاف محلول التوقف (عادة ، حمض الكبريتيك) لإيقاف التفاعل. ثم يتم الاحتفاظ اللوحة في قارئ ELISA ويتم قياس الكثافة البصرية (OD) للآبار. OD يتوافق مع كمية الأجسام المضادة في مصل الاختبار.

باستخدام تركيزات الأجسام المضادة المعروفة ، يمكن إنشاء رسم بياني. يتم رسم تراكيز الأجسام المضادة على المحور X ويتم رسم ODs المطابقة على محور Y ويتم رسم المنحنى. من خلال استيفاء قيمة OD من مصل الاختبار ، يتم تحديد تركيز الأجسام المضادة في مصل الاختبار.

ELISA لفحص المضاد:

يتم تلويث جسم مضاد أحادي النسيلة معروف (يُشار إليه بالأجسام المضادة الأولية) إلى مولد مضاد على آبار الميكروتير.

↓

يضاف العينة المفترض أن تحتوي على المستضد إلى البئر وتحضن.

أنا. إذا كانت العينة تحتوي على المستضد المقابل ، يرتبط المستضد بالجسم المضاد الموجود على البئر ويكوّن مركبًا مضادًا لجسم مضاد.

↓

يتم غسل الآبار لإزالة المواد غير المترابطة.

↓

يضاف إنزيم معروف mAb مترافق (يسمى مترافقة) ضد المستضد إلى الآبار ويتم تحضين الصفيحة.

أنا. إذا كان البئر يحتوي على مركب مستضد-جسم مضاد ، يرتبط الاتحاد بمولد الضد في المجمع.

ثانيا. إذا لم يكن هناك مركب مضاد مستضد ، يبقى المترافق في المحلول.

↓

يتم غسل الآبار لإزالة الاتحاد غير المقيد. يتم إضافة طبقة أساسية مناسبة وتحضينها.

أنا. إذا كان هناك اتحاد في البئر ، فإن إنزيم الاتحاد يقسم الركيزة وينتج منتجًا ملونًا.

ثالثا. يشير غياب تطور اللون إلى عدم وجود مستضد في العينة (ضد الأجسام المضادة المغلفة على الآبار).

↓

يضاف محلول وقف لإيقاف التفاعل. يتم قراءة ODs من الآبار الفردية في قارئ ELISA. كما تم توضيحه سابقًا ، يتم إنشاء رسم بياني (يتكون من تركيزات مختلفة من المستضدات على المحور X والأجزاء المقابلة من OD على المحور Y) ويتم رسم المنحنى. يتم تحديد تركيز المستضد في عينة الاختبار عن طريق الاستكمال الداخلي لـ OD.

التقاط الأجسام المضادة بطريقة ELISA:

مغلفة الآبار من لوحة عيار الدقيقة مع الأجسام المضادة IgM المضادة للإنسان.

↓

يضاف مصل المريض ويحضن. الأجسام المضادة IgM في ربط المصل للأجسام المضادة IgM المضادة للبشر على الآبار.

يتم غسل الآبار ثم يتم إضافة مستضد معروف وحضنته.

أنا. إذا كانت الأجسام المضادة لـ IgM ضد المستضد موجودة في البئر ، فإن المستضد يرتبط بجسم مضاد IgM ويبقى في البئر.

↓

يتم غسل الآبار لإزالة مستضد غير منضم

↓

يتم إضافة إنزيم mAb مترافق مع المستضد وتحضينه.

أنا. إذا كان المستضد موجودًا في البئر (معقد مضاد IgM-IgM-antigen) ، فسوف يرتبط الاتحاد المقترن بالمستضد.

↓

يتم غسل الآبار لإزالة اتحادات غير منضم ويضاف الركيزة.

أنا. يشير تطور اللون إلى أن الأجسام المضادة لـ IgM ضد المستضد موجودة في مصل المريض.

ثانيا. يشير عدم تطور اللون إلى أن مصل المريض لا يحتوي على أضداد IgM ضد المستضد.

↓

يتم إضافة حل التوقف ويتم قياس ODs من الآبار بشكل فردي في قارئ ELISA. يمكن تحديد كمية الأجسام المضادة IgM ضد المستضد عن طريق رسم الرسم البياني كما هو موضح سابقا.

يمكن اعتماد إجراء مماثل للكشف عن الأجسام المضادة IgG ضد مستضد.

الأنزيمات المستخدمة عادة في تقنيات ELISA هي البيروكسيديز الفجل والفوسفاتيز القلوية (الجدول 27،3). تقترن هذه الانزيمات تساهميًا إلى mAbs. تعمل هذه الإنزيمات على مجموعة متنوعة من الركائز لإنتاج منتجات ملونة. بما أن الخطوة الأخيرة في طريقة ELISA هي إنزيمية ، فإن طريقة ELISA حساسة للغاية (أي أن التركيزات المنخفضة جداً من المستضد أو الجسم المضاد يمكن اكتشافها).

يتم تعزيز حساسية المقايسات ELISA باستخدام الكواشف الإضافية (على سبيل المثال ، biotin / avidinimmunoassay). في الآونة الأخيرة ، زيادة استخدام ركائز الفجل البيروكسيديز التي تنتج منتجات chemiluminescent حساسية. إن قياس معدل التفاعل ، بدلاً من مدى التفاعل في لحظة واحدة ثابتة ، يعطي نتائج دقيقة أكثر دقة لإلليسا.

الجدول 27-3: خصائص الإنزيمات المستخدمة في المقايسة المناعية للأنزيم:

البيوتين-افيدين المحسن ELISA:

بدلا من وضع العلامات على mAb مع إنزيم ، يمكن تسمية MAB مع البيوتين (فيتامين ب ₁₂ ).

↓

ثم يتم إضافة أنزيم المسمى avidin (مكون بروتين من بياض البيض).

↓

يلتصق أفيدين بالبيوتين بحساسية عالية جدًا وألفة. في وقت لاحق يتم إضافة الركيزة. يعمل الإنزيم (في مركب mAb-biotin-avidin-enzyme) على الركيزة وينتج منتجًا ملونًا.

كما يستخدم تحسين البيوتين افيدين في فحوصات Immuno- الفلورسنت.

إنزيمات الجسيمات الدقيقة من إنزيمات الجسيمات:

فبدلاً من طلاء الآبار ذات الألواح الصغرية الدقيقة مع المستضدات أو الأجسام المضادة ، يتم تلبيس خرزات صغيرة (قطر 1 مم) مع المستضد أو الجسم المضاد ويتم إجراء اختبارات ELISA. توفر الجسيمات الدقيقة مساحة أكبر لسطح المستضد أو الأضداد بحيث يمكن طلاء تركيزات أعلى من المستضد أو الجسم المضاد ، مما يساعد على تقصير الوقت اللازم للتفاعلات الملزمة.

إن المقايسة المناعية الفلورية المتشابهة مطابقة مع غيرها من تقييمات الأثر البيئي باستثناء أنها تستخدم ركائز فلورية. في fluorescent EIA ، يتم إنشاء fluorophore بواسطة تفاعل إنزيم. بعد إثارة fluorophore في الطول الموجي الأمثل ، ينبعث الضوء في الطول الموجي المميز. يتم قياس الضوء الفلوري المنبعث.

Fluoroimmunoassay حل الوقت:

هذه الطريقة تحتاج إلى أجهزة خاصة وعلامات لاصقة خاصة لزيادة حساسية الفحص. تظهر التسمية الفلورية المستخدمة في هذا الاختبار مضان مؤجل مع فترة زمنية من 100 نانوثانية أو أكثر بين الإثارة والانبعاث. معظم المواد المسؤولة عن الخلفية مضان لها فترة تسوس قصيرة. ولذلك ، فإن قياس إشارة مضان تأخر يقلل من تأثيرات مضان الخلفية.

ويتحقق هذا الغرض مع استخدام مقياس التألق الخاص الذي يعمل على حل الوقت والذي ينتج نبضة ضوئية سريعة تثير الفلوروفور. يقاس الإسفار قليلا بعد الإثارة. وبالتالي ، يمكن القضاء على تأثير الخلفية غير المحددة ، والتي تتعفن بشكل عام في أقل من 10 نانوثانية.

فلورووفوريس عرض تأخر تأخر:

أنا. مشتقات البيرين مع وقت الاضمحلال ما يقرب من 100 نانوثانية.

ثانيا. تسميات شيلات المعادن الأرضية النادرة (مثل اليوروبيوم (Eu ³⁺ ) ، السماريوم (Sm ³⁺ ) ، والتيربيوم (Tb ³⁺ ) [] التي تحتوي على وقت طويل جدًا للتآكل يتراوح من 50 إلى 100 ميكرو ثانية.

Chemiluminescent Immunoassay:

تستخدم المناعية المناعية Chemiluminescent (CL-EIAs) ركائز chemiluminescent التي تتفاعل مع الانزيمات المختلفة. يولد تفاعل إنزيم الركيزة الكيميائي الضوء ، مشابهًا للتلألؤ بيولوجي. تعتبر أنظمة تقييم التأثير البيئي ذات التحلل الكيميائي تحسينًا واضحًا على RIAs من حيث الحساسية وكفاءة الوقت والبساطة الإجرائية.

استخدام المناعية الكيميائية الكيميائية استخدام جزيء كيميائي توليد جزيئات كتسميات.

أنا. مشتقات لومينول

ثانيا. استرات Acridinium

ثالثا. مشتقات نيتروفينيل أكسالات

د. الروثينيوم ثلاثي بيكربيل مع تريبيرولاميني لالتهاب كهربي

5. بشكل أساسي ، لا تختلف طرق الاختبار عن RIAs / FIAs.