التطورات الحديثة في تشخيص الملاريا

التطورات الحديثة في تشخيص الملاريا - HL Gupta ، VK Talwar ، A Rohtagi!

المقدمة:

تعتبر الملاريا في الهند مشكلة صحية كبرى. كانت هناك حالات تفشي متكررة في ولايتي راجاستان وشمال شرق الولايات المتحدة. في ولاية راجاستان الإصابة P. المنجلية في زيادة. في دلهي P. vivax هو أكثر الأنواع شيوعًا ، ولكن P. falciparum يواجهها أيضًا. الملاريا ، مشكلة عالمية ، تقتل ما بين 1.5 إلى 2.7 مليون شخص كل عام. بعبارة أخرى ، يقتل شخصًا واحدًا (غالبًا طفل عمره 5 سنوات) كل 12 ثانية. بالإضافة إلى ذلك ، يصاب 300-500 مليون شخص بالمرض كل عام.

للسيطرة على المرض التشخيص السريع والدقيق هو الأكثر أهمية. غالبًا ما يتم تشخيص مرض الملاريا فقط على أساس الأعراض السريرية ، على الرغم من أن دقته لا تقل عن 50٪. أحدث تقنيات التشخيص المتقدمة متاحة الآن. كانت الأبحاث التي أُجريت مؤخرًا استنادًا إلى المناعية سريعة (<10 دقيقة / اختبار) وعلى الأقل حساسة مثل الفحص المجهري التقليدي.

الميكروسكوب الضوئي: مسحات الدم السميكة والرقيقة:

كان إجراء المختبر المقبول تقليديا لتشخيص الملاريا هو الفحص المجهري Giemsa ، أو لطخات الدم الملطخة بالميدان. من الناحية المثالية ، ينبغي الحصول على الدم عن طريق وخز الإصبع. ومع ذلك ، فإن الدم الذي يتم الحصول عليه عن طريق بزل الوريد ومضاد التخثر (EDTA أو الهيبارين) يكون مقبولًا إذا تم فحصه على الفور. يجب أن تكون كل من مسحات سميكة ورقيقة. تشويه سميك ، تركيز الخلايا الحمراء 20-30 مرة على سطح صغير ، يزيد من حساسية هذه التقنية وأفضل بكثير من مسحات رقيقة. ومع ذلك ، فإن اللطخة الرقيقة أكثر تحديدًا.

هو المعيار الذهبي المقبول للتشخيص ولكنه يعتمد على كثافة العمل ، وتفسير النتائج يتطلب خبرة كبيرة ، خاصة مع انخفاض طفيليات الدم. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن بسهولة غزو الطفيليات المنجلية P ، والتي غالباً ما يتم عزلها بعيداً عن الدم المحيطي.

الكمي من الطفيليات عن طريق فحص مسحات الدم:

هناك العديد من الطرق لتحديد طفيليات الملاريا في مسحات سميكة. ويمكن أيضا قياس مستويات الطفيليات عن طريق فحص لطخة الدم رقيقة. العيب الرئيسي في مسحات سميكة هو أنه غالبا ما يتطلب درجة معينة من الخبرة التي قد تكون غير متوفرة.

نظريًا ، يجب على الفاحص أن يحصي الحقول التي تحتوي على 20 أو أكثر من leucocytes / hpf. في الواقع ، الحقول التي تحتوي على 20 أو أكثر من كرات الدم البيضاء تكون سميكة للغاية ولا يمكن الاعتماد عليها ، في حين أن الحقول التي يسهل قراءتها هي تلك التي تحتوي على خمس أو ست كرات بيضاء فقط / hpf.

قبل التلطيخ ، يجب أن يكون الفاحص قادراً على قراءة المطبوعات من خلال مسحة دم سميكة ومجهزة جيداً. إن فحص المسحات الرقيقة هو واحد فقط من حساسية فحص الفحصات السميكة. وهكذا ، على الرغم من أن فحص مسحات الدم مقبول على أنه "معيار ذهبي" عالمي ، فإنه لا يوجد في الواقع طريقة مفردة موحدة تستخدم من قبل جميع الباحثين لتحديد كمية الطفيليات عن طريق عد الطفيليات في مسحات سميكة.

بالإضافة إلى ذلك ، وفي ظل وجود موظفين مدربين ، فإن نقص المجاهر يحد من فائدة فحص اللطاخة الدموية في العديد من المناطق الموبوءة. واعترافا بهذه القيود ، تم تطوير تقنيات بديلة لتشخيص الملاريا.

الميكروسكوب الفلوري:

ثلاثة تقنيات الفلورسنت تبشر بالخير لتشخيص الملاريا.

هؤلاء هم:

(ط) طريقة المعطف الكمي (OBC) الكمية المتاحة كحقيبة تجارية

(الثاني) عملية Kawamoto أكريدين أورانج (AO) و

(ثالثا) إجراء Benzothiocarboxypurine (BCP).

هذه التقنيات الثلاثة سريعة وسهلة التنفيذ. عندما يكون هناك أكثر من 100 طفيلي / ميكرولتر ، فإنها تثبت حساسية وخصوصية تعادل تلك التي يتم الحصول عليها عن طريق فحص سميك التشويه.

تستخدم كل من أساليب OBC و Kawamoto أكريدين أورانج (AO) مثل الفلورانكروم لتلطيخ الأحماض النووية لطفيليات الملاريا في عينة. BCP هو أيضا fluorochrome ، الذي يصبغ الأحماض النووية. AO هو أحماض نوية غير محددة والبقع من جميع أنواع الخلايا.

وبالتالي ، يحتاج الفاحص لتعلم التمييز بين الطفيليات الملون الفلورسنت من الخلايا الأخرى والحطام الخلوي. كانت حساسية تلطيخ AO مع مستويات الطفيليات أقل من 100 طفيلي / ميكرولتر 41.7-93 في المائة.

خصوصية تلوين AP ل P. vivax و P. falciparum هي 52 و 93 في المائة على التوالي. طريقة BCP لديه حساسية وخصوصية أكثر من 90 في المائة. وجود قيود مهمة على الطرق القائمة على AO و BCP هو عدم قدرتها على التفريق بين أنواع Plasmodium. AO خطرة وتتطلب متطلبات التخلص الخاصة.

OBC و BCP أكثر تطلبا من الناحية الفنية من Kawamoto. تتطلب أساليب Kawamoto و AO معدات وإمدادات خاصة وأكثر تكلفة. يمكن أن يكون سعر المجهر مضان عامل مقيد للمختبرات المهتمة في استخدام هذه الأساليب.

كشف متواليات الحمض النووي المحددة:

قد يكون اكتشاف تسلسل الحمض النووي الخاص بطفيليات Plasmodium مفيدًا. في التقنيات القائمة على تفاعل البلمرة المتسلسل PCR ، يتم الكشف عن تتابع الهدف المضخم بواسطة المسابير الداخلية أو تحليلها بواسطة الترحيل الكهربائي للهلام. الميزة الرئيسية لاستخدام تقنية تعتمد على تفاعل البوليميراز المتسلسل هي القدرة على اكتشاف "انخفاض طفيلية الدم". يمكن الكشف عن الالتهابات مع الطفيليات الحية مع خصوصية 100 في المائة.

ومع ذلك ، فإن هذه التقنيات باهظة التكلفة وكثيفة العمالة ، وتتطلب خبرة فنية واسعة ، وتنطوي على خطوات متعددة ، ولا يمكن استخدامها للتمييز بين الكائنات الحية المجدية وغير القابلة للبقاء.

قد تؤدي مثبطات PCR الموجودة بشكل طبيعي في عينات الدم إلى عدد كبير من النتائج السلبية الكاذبة. نتائج إيجابية كاذبة ، بسبب تلوث المرحل ، كما تم تسجيلها.

وقد استخدمت التقنيات القائمة على تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) لفحص المتبرعين في منطقة تتوطن فيها الملاريا. إن حساسية وخصوصية الطرق القائمة على تفاعل البلمرة المتسلسل PCR المقدر باستخدام فحص مسحات الدم "كمعيار ذهبي" ، تبلغ 90٪ أو أكثر.

بالإضافة إلى ذلك ، فإن المزيد من التقدم في تكنولوجيا تفاعل البلمرة المتسلسل قد يسمح قريباً بتمييز الطفيليات القابلة للحياة عن غير قابلة للتطبيق. إن الفائدة الحالية لهذه التكنولوجيا محدودة بسبب الحاجة إلى معدات مختبرية مكلفة ومخصصة ، وموظفين مدربين على التكنولوجيات الوراثية ومرافق "الغرفة النظيفة" ، وبتكلفة عالية من الإنزيمات والبرايمرات المستخدمة.

كشف المستضد:

كانت اختبارات الكشف عن الأجسام المضادة للملاريا محدودة في الحساسية وقدرتها على التمييز النشط من الإصابات السابقة. الجيل الجديد ، اختبارات التقاط المستضدات قادرة على اكتشاف عدد أقل من الطفيليات وتحقيق نتائج سريعة (10-15 دقيقة). وهي مجموعات متوفرة تجاريا ، والتي تشمل جميع الكواشف اللازمة ، ولا تحتاج إلى تدريب أو معدات مكثفة.

هناك نوعان من المستضدات الطفيلية المستخدمة في الاختبارات التشخيصية السريعة الجديدة ، والبروتين الغني بالبروتين 2 (HRP-2) ، والذي ينتج فقط من قبل P. Falciparum ومستضد اللاكتات اللاكتات - dehydrogenase (pLDH) ، الذي تنتجه كل أربعة أنواع البلازموديوم تصيب الإنسان. يتم إفراز كل من المستضدات في الدم عن طريق جميع المراحل اللاجنسية من الطفيلي. يتم إنتاج مستضد pLDH أيضا من قبل gametocytes.

أحدث اختبارات التقاط المستضدات سريعة وسهلة التنفيذ ، ولديها حدود للاكتشاف مماثلة لتلك الموجودة في الفحص المجهري عالي الجودة (أي 100- 200 طفيل / ميكرولتر) .عند وجود أكثر من 60-100 طفيلية / ميكرولتر ، 2 الاختبارات القائمة على درجة عالية (> 90 ٪) الحساسة و (> 90 ٪) محددة ، بالمقارنة مع المجهري تشويه سميك.

حاليا ، يتوفر اثنان من هذه الاختبارات تجاريا ، واختبار ParaSight F واختبار تكنولوجيا المعلومات والاتصالات (immunochromatographic) الملاريا Pf. يتم إجراء كل من الاختبارات على عينات وخز وخز ، والكشف فقط عن الملاريا المنجلية P. falciparum.

وهي تستند إلى الأجسام المضادة أحادية النسيلة إلى HRP-2 ، التي يتم تثبيتها على شرائط nitrocellulose ، لإنتاج اختبارات الغمامة أو الورق المقوى (اختبار تكنولوجيا المعلومات والاتصالات). في كل اختبار ، يشار إلى نتيجة إيجابية من خلال ظهور خط أحمر على شريط الاختبار ، حيث يتم تثبيت الأجسام المضادة وحيدة النسيلة.

يحتوي كلا الاختبارين أيضًا على عنصر تحكم مدمج ؛ يجب أن يظهر خط التحكم ليعتبر الاختبار صالحًا. حساسية وخصوصية اختبار ParaSight F هي 88 و 97 في المائة ، على التوالي ، مقارنة مع PCR.

على الرغم من أن الاختبارات المصلية المستندة إلى HRP-2 قد سمحت بتشخيص سريع للملاريا المنجلية ، إلا أنها ذات فائدة محدودة. بما أن HRP-2 موجود فقط في P. falciparum ، فإن الاختبارات التي تعتمد على الكشف عن HRP-2 سلبية مع العدوى التي تسببها vivax أو البيضاوي أو الملاريا.

وبالتالي ، فإن العديد من حالات الملاريا غير المنجلية قد تُساء تشخيصها على أنها سلبية للملاريا. وهناك قيد آخر للاختبارات القائمة على HRP-2 هو أن العلاج HRP-2 يستمر في الدم بعد فترة طويلة من اختفاء الأعراض السريرية وتطهير الطفيليات على ما يبدو من المضيف.

في الواقع ، تم اكتشاف HRP-2 في المومياوات. وبالتالي ، قد لا تكون اختبارات هذا المستضد مفيدة في فحص السكان الأصليين في المناطق الموبوءة ، والذين قد يكون لديهم طفيليات مستمرة منخفضة المستوى. لا يمكن فهم السبب المحتمل لاستمرار مستضد HRP-2 بشكل جيد ؛ قد يعكس وجود طفيليات كامنة ، قابلة للحياة (ربما نتيجة فشل العلاج) أو من مركبات الأجسام المضادة للمستضد القابل للذوبان.

قد يعتمد استمرار أيضا على نوع العلاج المضادة للملاريا وضعت. قد تستمر إشارة HRP-2 لمدة 19 يومًا بعد العلاج الفعال من الكينين والدوكسيسيكلين. كما لوحظ استمرار وجود مستضد الهيستامين 2 - HRP خلال وبعد العلاج بالأرتيميثير.

تتعلق قيود أخرى بشكل خاص بالجوانب الفنية لنظام HRP-2. على سبيل المثال ، قد يتفاعل IgG أحادي النسيلة المستخدم في نظام ParaSight F مع العامل الرثياني ويتسبب في استجابة إيجابية خاطئة.

يستخدم اختبار Pf ICT تقنية وحيدة النسيلة IgM ، والتي لا تتفاعل بشكل متقاطع ولا توجد تقارير عن ردود فعل إيجابية خاطئة تحدث مع هذا الاختبار بسبب عامل الروماتويد. ومع ذلك ، يتطلب اختبار تكنولوجيا المعلومات والاتصالات Pf التخزين عند 4 درجة مئوية ، مما يحد من فائدته في الحالات الميدانية.

فحوصات مصلية قائمة على pLDH:

وتستند أحدث الاختبارات المصلية السريعة لتشخيص الملاريا على الكشف عن pLDH. مثل الاختبارات القائمة على HRP-2 ، هذه الاختبارات حساسة ، محددة وسهلة التنفيذ ، مع النتائج يمكن الحصول عليها في أقل من 15 دقيقة.

كما يمكن للمقايسات القائمة على pLDH التمييز بين P. falciparum وأنواع Plasmodium الأخرى ، وبما أن pLDH تنتج فقط من طفيليات قابلة للحياة ، فهي مفيدة أيضًا في مراقبة العلاج المضاد للملاريا. يتم تمييز pLDH من P. falciparum من LDH المضيف (h-LDH) مع 3-acetylpyridine adenine dinucleotide (APAD) ، وهو تماثلي من Nicotinamide Adenine Dinucleotide (NAD).

المقاييس القائمة على pLDH متوفرة في شكلين ، مقياس شبه كمي وجاف (أوبتيمال) ؛ ومقايسة الكميات المناعية والإنزيمية. يستخدم اختبار OptiMAL نوعين من الأضداد وحيدة النسيلة ، أحدهما محدد لـ P. falciparum والآخر يتعرف على كل 4 Plasmodia.

يتم خلط عينة الدم المختبرة (10 ميكرولتر من وخز الإصبع ، الدم الكامل ، أو الهيموليزين المجمد) مع 3oµL ، عازل lysing الذي يحتوي على جسم مضاد أحادي النسيلة مترافق. يسمح هذا الخليط للنقع في OptiMAL ، مقياس الجرعة.

بعد 3 دقائق ، يضاف 100 حاجز إزالة تخليص ميكرولتر. إذا كانت P. falciparum موجودة في عينة الدم ، فإن ثلاثة خطوط (بما في ذلك واحدة ، في أعلى كل عصا ، تمثل السيطرة الإيجابية) تتطور على الغموض.

يشير خطان إلى P. vivax أو P. malariae أو أحيانًا P. ovale. يحتوي شريط OptiMal-2 المنسق حديثًا على ثلاثة خطوط اختبار وخط تحكم إيجابي ، مما يسمح بتحديد جميع أنواع Plasmodium الأربعة.

كل اختبار يعتبر فقط ualid إذا تطور خط التحكم. تم اختبار الأضداد وحيدة النسيلة المستخدمة في اختبار OptiMAL بشكل شامل للتفاعل التبادلي مع LDH من الليشمانيا ، babesia والبكتيريا المسببة للأمراض أو الفطريات ولم يتم العثور على أي دليل على هذا التفاعل المتبادل.

تم العثور على HRP-2 جيدًا بعد تطفل الدم المحيطي. على الرغم من أن مستويات pLDH تتابع عن كثب تطفل الدم المحيطي وانخفضت إلى قيم غير قابلة للكشف بعد 3-5 أيام من العلاج بالكينين و الدوكسيسيكلين ، إلا أن مستويات مستضد HRP-2 انخفضت بعد 19 يومًا فقط ، بعد أن يكون المريض عرضًا واضحًا كما أنه طفيلي على ما يبدو.

لذا يجب أن يكون فحص OptiMAL أداة قيمة في مراقبة العلاج المضاد للملاريا. إزالة تطفل الدم وتطهير pLDH يوازيان بعضهما البعض.

فحوصات OptiMAL متعددة جدًا. ويمتلك اختبار OptiMAL حساسيات تتراوح بين 94 و 88 في المائة على التوالي وخصوصية بنسبة 100 و 99 في المائة لكل من P. vivax و P. falciparum ، على التوالي ، عند مقارنتها بمسحات الدم.

يمكن استخدام هذا الاختبار كأداة وبائية لأنه في المناطق التي ينتشر فيها أكثر من نوع واحد من Plasmodium ، يمكن استخدامه لتحديد أنواع Plasmodium التي تصيب المرضى في كل قرية بسرعة والسماح للعاملين في مجال الصحة العامة بتقديم العلاج الكيميائي الأنسب .

الاستنتاجات:

في السنوات القليلة الماضية ، أدت الجهود المبذولة لاستبدال القراءة التقليدية والمملة لطخات الدم (وهي طريقة طورت منذ ما يقرب من 100 عام) إلى تقنيات للكشف عن طفيليات الملاريا التي تعطي حساسية تعادل أو أفضل من الفحص المجهري.

على الرغم من أن الطرق المعتمدة على تفاعل البلمرة المتسلسل PCR هي الأكثر حساسية ، فهي مكلفة للغاية وتحتاج إلى مثل هذه المعدات المتخصصة والتدريب التي من غير المحتمل استخدامها في التشخيص الروتيني في معظم البلدان النامية.

وهي مفيدة بشكل خاص للدراسات المتعلقة بالاختلافات في الإجهاد ، والطفرات ، والجينات المشاركة في مقاومة الأدوية في الطفيلي ، ولإظهار مستوى الارتباط بين السلالات المصاحبة لتفشي الملاريا المختلفة. التشخيصات الواعِدة والواعدة للملاريا الجديدة هي اختبارات مقياس المصل.

هذه الاختبارات ، بما في ذلك ParaSight F ، و ICT Pf Test و OptiMAL ، سهلة الاستخدام ، وسهلة التفسير ، وتنتج النتائج في 15 دقيقة أو أقل. هذه الاختبارات تكاد تكون حساسة مثل الفحص المجهري لطخات الدم ، ولكنها لا تتطلب موظفين ذوي مهارة عالية لأداء أو لتفسير النتائج.

يتمتع اختبار OptiMAL بالميزات الإضافية المتمثلة في القدرة على اكتشاف جميع أنواع Plaspiodium الأربعة ومتابعة فعالية العلاج الدوائي ، حيث يقيس إنزيمًا ينتج فقط من الطفيليات الحية.

على الرغم من أن اختبار المقاييس له حدودان واضحتان ، إلا أنه لا ينبغي منع هذه الاختبارات من الحصول على قبول واسع النطاق. القيد الأول هو الحساسية. تمتلك المقايسات الثلاثة المسوقة حاليًا عتبات حساسية من 50-100 من الطفيليات / .1. وتتراوح حساسية العينات مع <50 طفيل / ميكرولتر من 50٪ إلى 70٪.

قد لا يكون هذا المستوى من الحساسية مشكلة كبيرة بالنسبة لأولئك الذين يعيشون بشكل دائم في المناطق الموبوءة ، والذين غالباً ما لا يتلقون العلاج إلا إذا كان لديهم أكثر من 500 طفيلي / دم ، ولكن قد يشكل مشكلة في تشخيص الملاريا لدى هؤلاء الأفراد من مناطق غير موبوءة ولكنها تعيش أو تعمل أو تسافر في مناطق متوطنة.

ومع ذلك ، حيث أن الغالبية العظمى من مرضى الملاريا لديهم مستويات من الطفيليات أعلى بكثير من 50 طفيليًا / ميكرولتر من المرضى سيشخصون خطأً إذا تم استخدام اختبارات القياس بشكل روتيني. والقيد الثاني لهذه الاختبارات ، على الأقل حاليًا ، هو تكلفتها.

ترى منظمة الصحة العالمية أنه بالنسبة لمن يعيشون في المناطق الموبوءة للاستفادة منها ، يجب أن تكلف اختبارات التشخيص الخاصة بالملاريا أقل من 0.40 دولار أمريكي / عينة. ما لم يتم إنتاج اختبارات قياس الأعداد بأعداد هائلة ، فإن هذا السعر غير قابل للتحقيق وغير عملي لمقابلة المصنعين.

تعتمد التكاليف الحالية لاختبارات مقياس الأثر على موقع المشتري والحجم المطلوب. على سبيل المثال ، تتراوح تكاليف اختبارات تكنولوجيا المعلومات والاتصالات من 1.30 دولار أمريكي في الاختبار في الدول النامية. تبيع اختبارات Para 0Sight F مقابل 1.20 دولار أمريكي / اختبار. ويبيع شريط optiMAL حاليًا مقابل 3.00 دولارات أمريكية / اختبار.