HLA: طرق اختبار التوافق النسيجي
طرق اختبار التوافق النسيجي!
نظام HLA هو على نطاق واسع متعدد الأشكال. تم العثور على طبيعة متعددة الأشكال من الأليلات HLA في البداية وتعريفها من خلال طرق مصلية وتم إعطاء أعداد المستضدات HLA. في وقت لاحق تبين أن المستضدات التي لها نفس الخصائص المصلية قد يكون لها تسلسلات أحماض أمينية مختلفة. بحلول عام 1999 ، تجاوز عدد أليلات HLA المعروفة 1000 ، وما زال العدد يتزايد. بسبب تعدد الأشكال الواسع ، فإن تسمية الأليلات HLA معقدة ، كما أنه من الصعب على الشخص أن يفهم التسمية ، ما لم يكن الشخص في مجال التوافق النسيجي.
تم تعيين الألائل المتسلسلة الأولى بأسماء برقمين يتوافقان مع خصوصياتهما المصلية. يتبع الرقمان الأولان رقمان آخران يشيران إلى الترتيب الزمني لتسمية لجنة التسمية التابعة لمنظمة الصحة العالمية لعوامل نظام HLA. (على سبيل المثال ، تم وسم الأليل الأول المتسلسل من جين HLA-A2 باسم HLA-A 0201 ، وتم تسمية الأليل الثاني المتسلسل HLA-A 0202.)
تتم كتابة HLA بطرق الكتابة المصلية أو طرق الكتابة الجزيئية. تقوم طرق الكتابة HLA المصلية باكتشاف حواتس جزيئات HLA ، بينما تكتشف الطرق الجزيئية تسلسلات النوكليوتيدات.
أنا. يشار إلى الكتابة HLA التي تحدد مجموعات من الأليلات (عادة ما يقارب الخصوصيات المصلية) على أنها منخفضة الدقة أو الكتابة العامة (على سبيل المثال ، HLA- DRBl-04).
ثانيا. تتم الإشارة إلى الكتابة التي تحل جميع الأليلات المعروفة باسم الكتابة عالية الدقة HLA (على سبيل المثال ، HLA-DR BI x401).
ثالثا. ويشار إلى الكتابة التي تحل إلى ما هو أبعد من الخصوصيات المصلية ، ولكنها لا تحقق مستوى الأليل ، كطبقة كتابة متوسطة (على سبيل المثال ، HLA-DRBl-0401/09/13/16/21/26/33).
أنشأ برنامج المانحين الوطني للمخلفات كودًا لتسهيل إدارة هذه البيانات المعقدة ذات الدقة المتوسطة. في هذا النظام ، يكون اسم HLA-BRBl-0401/09/13/16/21/26/23 / DRBl-04EJV.
اختبار التوافق النسيجي بالطرق السيرولوجية:
تُستخدم الخلايا الليمفاوية في كتابة HLA المصلي ، وفحص الجسم المضاد ، والمطابقة المتقاطعة.
عزل الخلايا الليمفاوية لكشف HLA
أنا. يتم خلط الدم الوريدي المحيطي مع Ficoll- Hypaque والطرد المركزي. يتم استنشاق الطبقة المحتوية على خلايا وحيدة النواة في الدم المحيطي ، وغسلها ، واستخدامها.
ثانيا. يتم استخدام الخلايا الليمفاوية المعزولة من الغدد الليمفاوية والطحال من الجثث.
ثالثا. تتم كتابة HLA للمستضدات من الدرجة الثانية مع تجمعات خلايا B المخصبة (حوالي 80٪ من خلايا T الطبيعية في الدم المحيطي تستريح الخلايا التائية التي تفتقر إلى المستضدات من الدرجة الثانية على سطحها).
د. يتم استخدام حبات مغناطيسية مغلفة بمضاد CD2 أو مضادات CD3 لعزل الخلايا التائية ؛ وتستخدم مغناطيسية مغلفة المضادة CD19 mAbs لعزل الخلايا البائية.
الكشف عن المستضدات HLA من الخلايا الليمفاوية:
فحص السمية الخلوية الصغرى هو اختبار السمية الخلوية اللمفاوية. صواني الكتابة المجمدة التي تحتوي على الآبار المغلفة بأجسام مضادة مختلفة ضد المستضدات HLA متاحة تجارياً.
يتم توزيع ما يقرب من 2000 خلية ليمفاوية في كل بئر من الصهريج ويتم تحضينها لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. (الأجسام المضادة في كل بئر ترتبط بمستضدات HLA محددة على سطح الخلايا الليمفاوية ، إن وجدت.)
↓
يضاف خمسة مكمّل ميكرولتر (عادة مصل أرنب) إلى كل بئر ويحتضن لمدة 60 دقيقة ، (تتسبب البروتينات المتممة في موت الخلايا الليمفاوية المغلفة بـ mAbs. وفي غياب ربط mAb مع الخلايا الليمفاوية ، لا يتم تنشيط المكمل والخلايا الليمفاوية لا تقتل).
↓
تضاف صبغة يوسين Y متبوعًا بالفورمالدهيد (يثبت الفورمالدهيد التفاعل).
↓
ثم يتم حساب الخلايا الميتة والخلايا الحية في كل بئر تحت المجهر الطوري.
أنا. الخلايا المتورمة والمظلمة هي خلايا ميتة (يدخل صبغة يوزين Y في الخلايا الميتة).
ثانيا. الخلايا الساطعة والمنكسرة هي خلايا حية (لا يدخل الصبغة eosin Y في الخلايا الحية).
يتم عرض كل بئر في الدرج بشكل فردي للخلايا الميتة والخلايا الحية. يتم حساب النسبة المئوية للخلايا الميتة في كل بئر ويتم إجراء التقييم وفقًا للجدول 27.5.
الجدول 27-5: تقييم اختبار السمية الخلوية الليمفاوية لـ HLA:
نسبة اللمفاويات الميتة في البئر | أحرز هدفا | ترجمة |
0-10 | 1 | نفي |
11-20 | 2 | مشكوك فيه إيجابية |
21-50 | 4 | ضعيفة إيجابية |
51-80 | 6 | إيجابي |
81-100 | 8 | ايجابية قوية |
يتم تحديد نوع HLA للفرد بتفسير تفاعل الخلايا الليمفاوية للفرد بمضادات مختلفة تستخدم في اختبار السمية الخلوية اللمفاوية.
أنا. ومن المتوقع أن يكون لكل فرد اثنين من HLA-A ، واثنين من HLA-B ، واثنين من مستضدات HLA-C على سطح الخلايا الليمفاوية.
ثانيا. إذا أظهر الفرد واحدًا فقط من مستضدات HLA-A أو HLA-B أو HLA-C في الاختبار ، فمن المحتمل أن يكون ذلك متماثل الزيجوت لهذا المستضد المعين أو لوحة antisera المستخدمة في الاختبار لا تحتوي على الجسم المضاد المحدد ضد الثانية مستضد أو هناك انخفاض التعبير عن جزيئات HLA على سطح الخلايا الليمفاوية.
يتم إجراء اختبار السمية الخلوية الليمفاوية على المستضدات لمستضدات HLA-DR و HLA-DQ باستخدام الخلايا البائية المعزولة بواسطة حبات مغنطيسية مغلفة أو خلايا B معزولة على صوف نايلون.
يتم الحصول على معظم الأمصال الكتابة HLA من النساء multarsous. وبما أن النساء الجسديات يتعرضن بشكل متكرر لمستضدات HLA للأجنة ، فإن الأمعاء من النساء المتعددات لديهم أجسام مضادة لمستضدات HLA. يتم استخدام ما يقرب من 200 antisera مختلفة لكتابة مستضدات HLA الفردية.
كان يعتقد في البداية أن mAbs لكل من مستضد HLA يمكن تطويره وسوف تكون الكتابة HLA بسيطة. لكن العديد من mAbs ترتبط بالحصباء المشتركة بدلا من ذلك إلى الحواتم الخاصة لمستضدات HLA. علاوة على ذلك ، فإن العديد من mAbs الفئران لا تُثَبِّت تكاملاً (ومن ثم فإن استخدامها في المكملات التثقيفية السمية الخلوية التكميلية محدود).
ومع ذلك ، يمكن استخدام mAbs الفئران في طريقة ELISA وتدفق الخلوي ، والتي لا تتطلب مكمل. في الآونة الأخيرة ، تفضل العديد من المختبرات استخدام لغة HLA الجزيئية ، بدلاً من كتابة HLA المصلي.
فحص مصل المستلم المزروع للأجسام المضادة ضد المستضدات L-ILA (فحص الأجسام المضادة):
عادة ما يتم وجود الأجسام المضادة لمستضدات HLA في مصل المتلقي المنتظر لزرع الأعضاء عن طريق السمية الخلوية اللمفاوية. يتم خلط الخلايا الليمفاوية مع المستضدات HLA المعروفة وتكملة مع مصل المتلقي. بعد الاحتضان المناسب ، يتم حساب الخلايا الليمفاوية الميتة والخلايا اللمفية الحية. يتم بعد ذلك حساب النسبة المئوية للأجسام المضادة التفاعلي (PRA).
PRA = عدد الخلايا الإيجابية / عدد خلايا اللوحة الكلية × 100
PRA يشير إلى مدى توعية المستلم الانتظار إلى مستضدات HLA.
طريقة ELISA لفحص الأجسام المضادة HLA في المصل:
طريقة ELISA سهلة وسريعة ولا تتطلب اللمفاويات الحية وكذلك مكملة. يتم تلبيس مستضدات HLA المنقاة من التقارب على جدران لوحة الميكروتيتير
↓
يضاف مصل المتلقي ويحضن
↓
بعد الغسيل ، يتم إضافة إنزيم مترافق مع مضاد للبكتيريا البشري وحضنته.
↓
بعد الغسيل ، يضاف الركيزة وتحضن.
أنا. يشير تطور اللون في بئر معين إلى وجود أجسام مضادة IgG ضد مولد HLA المطلي على ذلك البئر بعينه.
ثانيا. يشير عدم تطوير اللون في بئر معين إلى عدم وجود أجسام مضادة لمستضد HLA المحدد المغطى على هذا البئر.
مقياس التدفق الخلوي للكشف عن الأجسام المضادة HLA في المصل:
يتم تحضين الخرزات الصغيرة المغلفة مع المستضدات HLA مع مصل المريض ثم مع الأجسام المضادة IgG المضادة للإنفلونزا المسمى fluorescent. توفر النسبة المئوية للخرز اللطخة فوق الخلفية مقياس الأجسام المضادة التفاعليّة في لوحة المريض (PRA).
مطابقة الصليب:
إذا احتوى دم المستلم على أجسام مضادة ضد المستضدات HLA المانحة ، فإن مستضدات HLA الموجودة على الخلايا المانحة ستهاجم بواسطة الأجسام المضادة للمستلم ، عند الزرع. لذلك فمن الضروري قبل زراعة الأعضاء معرفة ما إذا كان لدى المتلقي أضداد ضد مستضدات HLA المانحة.
إذا كانت الأجسام المضادة المحددة للمستضد HLA المانحة موجودة في مصل المتلقي ، سيتم رفض الزرع. تتم مطابقة الصليب للكشف عن وجود الأجسام المضادة المصلية في انتظار المرسل ضد مستضدات HLA المانحة المقترحة.
السمية الخلوية الليمفاوية تتطابق مع اللمفاويات الدموية المحيطية:
يتم خلط الخلايا الليمفاوية في الدم التابعة للجهة المانحة المقترحة (التي تحتوي على 80٪ من الخلايا التائية (التي تحمل مولدات MHC من الفئة 1) و 20٪ من الخلايا البائية والخلايا الوراثية (التي تحمل مولدات MHC من الصنف I والمجموعة الثانية) مع مصل المستلم والمحتضنة. .
↓
تضاف المكملة واحتضانها.
↓
يضاف صبغة يوسين Y وحضنت.
أنا. يتم حساب عدد الخلايا الميتة والقابلة للحياة ، وتحسب نسبة الخلايا الميتة. 50٪ أو أكثر من الموت الخلوي يشير إلى تطابق إيجابي قوي (أي أن لدى مصل المتلقي أضداد قادرة على التفاعل مع مستضدات HLA المانحة). وهناك تطابق إيجابي قوي بين المتلقي والمانح المقترح هو موانع لزراعة الأعضاء من المتبرع إلى المتلقي.
لمعرفة ما إذا كانت الأجسام المضادة للمستلم موجهة ضد المستضدات من الصنف I أو من الدرجة الثانية ، يتم إجراء التزاوج عبر الخلية التائية السمية للخلية التائية (باستخدام الخلايا التائية المثرية) أو مطابقة الخلايا اللمفاوية لخلية الخلية اللمفاوية (باستخدام خلايا B المثرية) ، على التوالي.
مقياس التدفق الخلوي عبر القنوات هو أكثر حساسية من 30-250 مرة من الطرق المصلية البصرية للكشف عن الأجسام المضادة IgG ضد المستضدات HLA على سطح الخلايا الليمفاوية.
يتم تحضين الخلايا الليمفاوية الطرفية للمتبرع المقترح مع المسمى (على سبيل المثال ، صبغة الفلورسنت التي تصدر الضوء الأخضر) mAbs anti-CD3 ، التي ترتبط بالخلايا التائية.
↓
يتم فصل الخلايا الموصولة بعلامة ani-CD3 من الخلايا البائية في جهاز قياس التدفق الخلوي.
↓
تحضن الآن الخلايا التائية المنفصلة والملونة مع مصل المتلقي المنتظر.
أنا. الأجسام المضادة المصلية للمستقبل ضد مستضدات الخلايا التائية HLA المانحة ، إن وجدت ، سوف ترتبط بالخلايا T.
↓
بعد الغسيل ، يتم إضافة flurochrome (التي تنبعث منها لون ، بخلاف اللون الأخضر ، لون أحمر) المسمى مكافحة IgG لمكافحة الإنسان وحضنت.
ثانيا. سوف يرتبط ملصق IgG المضاد للبشر المسمى fluore بالأجسام المضادة لـ HLA الخاصة بالمستقبل ، والتي ترتبط بالخلايا التائية المانحة.
يحسب عداد التدفق الخلوي عدد الخلايا التائية (اللون الأحمر والأخضر) والخلايا التائية (اللون الأخضر) ويخلق المدرج التكراري.
التطابق المتقاطع للأجسام المضادة ضد اللمفاويات:
خلال مباراة متقاطعة ، قد تربط الأجسام المضادة ضد الخلايا الليمفاوية في مصل المستلم غير الخلايا اللمفاوية الخاصة بالمتبرع وتعطي نتيجة مطابقة كاذبة إيجابية. وبالتالي ، فإن الجهة المانحة غير مؤهلة بشكل خاطئ من التبرع بالأعضاء إلى المستلم المعين. يمكن للأجسام المضادة الذاتية أيضًا أن تخفي وجود أجسام مضادة معينة مضادة للتبرعات.
يتم الكشف عن وجود الأجسام المضادة للاللمفاويات عن طريق المباراة عبر السيارات ، والتي يتم الجمع بين الخلايا اللمفاوية والمصل الخاصة بالمستقبل في اختبار السمية الخلوية القياسية. يتم إجراء تطابقات الأضداد الذاتية بشكل متزامن مع جميع المباريات الحية للمانحين مقابل كل مصل يتم اختباره.
طرق البيولوجيا الجزيئية لكتابة HLA:
تستخدم معظم طرق الطباعة الجزيئية تقنية تفاعل البلمرة المتسلسل (PCR) لتضخيم مقاطع جينات HLA المطلوبة للكتابة بشكل انتقائي.
تسلسل خاص بالتسلسل (SSP)
يتم استخراج الحمض النووي للفرد من الخلايا أو الأنسجة
↓
يضاف الحمض النووي إلى الأنابيب التي تحتوي على مجموعات برايمر مختلفة لجينات HLA المختلفة. يتم تضمين مجموعة إضافية من الاشعال كتحكم إيجابي في التضخيم في جميع الأنابيب.
`↓
تمت إضافة المكونات الأخرى لتفاعل تفاعل البلمرة المتسلسل (مثل نيوكليوتيدات الدنا ، بوليميراز الدنا ، المخزن المؤقت) ويتم إجراء التدوير الحراري.
↓
يتم تكبير المنتجات الكهربائية في هلام مع بروميد إيثيديوم وتصويرها تحت ضوء الأشعة فوق البنفسجية.
أنا. يشير وجود النطاق إلى أن عينة الحمض النووي لها التسلسل المقابل لنوع HLA المعين.
ثانيا. يشير غياب الفرقة إلى أن عينة الحمض النووي لا تحتوي على التسلسل المحدد لنوع HLA.
ثالثا. يجب أن يكون نطاق التحكم في التضخيم الداخلي موجودًا للتأويل.
مجموعات من الاشعال لكتابة HLA متاحة تجاريا.
أنا. بالنسبة إلى HLA-A و B و C ، فإن كتابة ما يقرب من 100-200 تفاعلات مطلوبة.
ثانيا. ل HLA-DRB الكتابة عن 20-30 ردود الفعل مطلوبة.
تهجين مسبار النيوكليوتيد بالتحديد التسلسلي (SSOP):
تتضمن طريقة SSOP التضخيم الانتقائي لهدف HLA متبوعًا بالتهجين إلى لوحة من تحقيقات oligonucleotide. هناك نوعان من تنسيقات SSOP.
أنا. نقطة أو فتحة لطخة:
يرتبط الدنا المضخم بالدعم الصلب (مثل غشاء النايلون) ومسبار التهجين في الحل.
ثانيا. عكس نقطة أو فتحة لطخة:
يرتبط المسبار بالدعم الصلب ويتم تهجينه إلى الحمض النووي المتضخم في المحلول.
